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[期刊] 华北农学报
[作者]
刘祥
为构建水产致病菌溶藻弧菌附着定植因子ACFA原核表达载体,优化ACFA蛋白的诱导表达条件,制备ACFA蛋白小鼠多克隆抗体。通过分子克隆获得ACFA蛋白的表达菌株,利用切胶纯化获得ACFA蛋白,免疫小鼠制备多克隆抗体,采用ELISA法检测抗体滴度为1∶3 200倍,Western-Blotting法检测抗血清特异性较好。通过正交试验,获得ACFA菌株的最佳表达条件为:诱导时菌液OD600值0.5,加IPTG终浓度0.3 mmol/L,诱导时间8 h,诱导温度32℃;最佳培养条件为:葡萄糖浓度0,转速230 r/min,装液量50 m L。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
陈春琳 刘祥 俱雄
【目的】构建溶藻弧菌外膜蛋白OmpK原核表达载体,优化OmpK蛋白的诱导表达条件,制备OmpK蛋白小鼠多克隆抗体。【方法】通过PCR扩增获得ompK基因,连接pET-32a质粒构建OmpK-pET32a载体,将其转化大肠杆菌BL21后进行诱导表达。利用切胶纯化获得OmpK蛋白后,免疫小鼠制备OmpK蛋白多克隆抗体,采用ELISA法检测抗体效价,Western-Blotting法检测抗血清特异性。通过正交试验,获得OmpK菌株的最佳诱导表达条件与培养条件。【结果】PCR扩增获得了长816bp的ompK基因;成功构建了OmpK-pET32a载体,其诱导表达产物分子质量为30ku,与预期结果一致。E...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
刘祥
Ｏｍｐ Ｕ蛋白为溶藻弧菌主要外膜蛋白，具有很好的免疫原性，在疫苗上有很好的应用前景。本试验通过分子克隆获得Ｏｍｐ Ｕ蛋白的表达菌株，利用切胶纯化获得Ｏｍｐ Ｕ蛋白，免疫小鼠制备多克隆抗体，采用ＥＬＩＳＡ法检测抗体滴度为１∶３２００倍，ＷＥＳｔＥｒｎＢＬＯｔｔＩｎｇ法检测抗血清特异性较好。通过正交试验，获得Ｏｍｐ Ｕ菌株的最佳表达条件为：诱导时菌液ＯＤ６００值１，加Ｉｐｔｇ终浓度０．１ｍｍＯＬ／Ｌ，诱导时间８ ｈ，温度３２℃；最佳培养条件为：葡萄糖浓度０．４％，转速２３０ ｒ／ｍＩｎ，装液量５０ ｍ Ｌ。为Ｏｍｐ Ｕ工业发酵、蛋白功能与疫苗开发研究奠定基础。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
刘祥 俱雄 陈春琳
通过分子克隆,获得了Omp T蛋白的表达菌株;利用切胶纯化,获得了Omp T蛋白。用Omp T蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,采用ELISA法检测抗体滴度为1∶1 600,用Western Blotting法检测抗血清特异性较好。采用正交试验,获得Omp T菌株的适宜表达条件为诱导菌液OD600 nm为1.0,IPTG添加终浓度为0.3 mmol/L,诱导时间为8 h,诱导温度32℃;适宜培养条件为葡萄糖质量分数0%,转速230 r/min,装液量50 m L。
[期刊] 淡水渔业
[作者]
王艺舟 潘启华 王乾 夏必琳 罗君志 方健 邓羽 廖明聪 陈天圣
实验进行了青鱼(Mylopharyngodon piceus)Dazl基因的原核表达,兔抗青鱼源Dazl多克隆抗体的制备及抗体的特异性验证。首先将青鱼Dazl基因的编码区利用重组表达引物从pCS2-MpDazl质粒中扩增出来,经酶切后连接到pET-28a载体中,构建pET-28a-MpDazl重组表达载体。然后将pET-28a-MpDazl重组质粒转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中,利用异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,获得分子量为27 kD的Dazl重组蛋白。将纯化的Dazl重组蛋白作为抗原免疫家兔制备多克隆抗体,抗体的效价和特异性通过ELISA法和Western blot检测。结果:成功构建重组表达载体pET-28a-MpDazl;以0.5 mmol/L IPTG在37℃条件下诱导4 h可获得高效表达的Dazl重组蛋白;制备的兔抗青鱼Dazl多克隆抗体能够特异性识别原核表达Dazl蛋白、青鱼卵巢的内源Dazl蛋白以及细胞中过表达的Dazl蛋白,并证实了青鱼Dazl蛋白在性腺中表达的特异性。
[期刊] 水产学报
[作者]
丁炜东 曹哲明 曹丽萍
抗苗勒氏管激素(anti-mullerian hormone,AMH),也称苗勒氏管抑制物质(mullerianin hibiting substance,MIS),为肽类生长因子,属于TGF-β生长和分化因子家族。为研究AMH对奥利亚罗非鱼性腺发育的作用,应用DNAstar软件分析罗非鱼AMH基因的抗原性,选择抗原性较强的22～243氨基酸作为目的片段构建了AMH的原核表达载体并进行融合表达。首先利用RT-PCR方法从性腺中扩增出长约663bp的目的序列AMH基因,克隆至T载体中,经酶切鉴定和序列测定分析确认序列的正确性后将此片段克隆到表达载体pGEX-5x-1中构建重组表达质粒pGEX-A...
[期刊] 水产学报
[作者]
于淼 方健 李玲玉 薛亭 陈天圣
为深入研究鱼类干细胞多能性转录因子Nanog的功能,本实验进行了团头鲂Nanog基因的原核表达和多克隆抗体的制备。首先,从团头鲂卵巢克隆出Nanog基因的编码区,将其连接到p ET32a载体上构建原核表达载体。接着将重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,获得预期大小的Nanog重组蛋白,并获得大量蛋白以制备抗体。最后通过ELISA检测抗体的效价和采用Western blot技术检测Nanog抗体的特异性。结果显示,在37°C,0.5 mm
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
袁晓琴 刘梦茜 李春燕 陈仕怡 许丽惠 周五朵 吴异健 王全溪
根据鸡的蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)基因序列进行抗原肽分析,选择含大片段抗原表位区约1 500 bp的一段基因(151 515 bp)设计一对特异性引物后进行RT-PCR扩增,并构建pET-32a(+)-PERK重组质粒,将其转化至BL21(DE3)感受态细胞中.优化诱导表达条件,纯化重组蛋白后免疫兔并制备多克隆抗体.PCR鉴定、酶切鉴定和测序结果表明,pET-32a(+)-PERK重组质粒构建成功.SDS-PAGE电泳鉴定结果表明,重组蛋白在1.0 mmol·L-1IPTG、25℃下诱导9 h时的
[期刊] 西南农业学报
[作者]
刘祥
溶藻弧菌附着定植因子ＡＣＦＡ蛋白具有很好的免疫原性，在疫苗上有应用前景。本试验通过分子克隆获得ＡＣＦＡ蛋白的表达菌株，利用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ切胶纯化与尿素浓度梯度复性获得ＡＣＦＡ蛋白，免疫小鼠制备抗血清，ＷＥＳｔＥｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎＧ检测发现ＡＣＦＡ蛋白具有很好的抗原性。利用在线软件预测ＡＣＦＡ蛋白为亲水的分泌型蛋白，存在多个酶切位点；采用ｔＭＨＭＭ ＳＥｒｖＥｒ ｖ．２．０程序预测ＡＣＦＡ无跨膜结构并定位于细胞膜外；ＳｏＰＭＡ服务器预测ＡＣＦＡ二级结构中含无规则卷曲３２．５６％，Ａ－螺旋２５．５８％，β－转角６．０５％，β－片层３５．８１％。通过ＳｉＧｎＡｌ Ｐ ４．１软件分析显示，ＡＣＦＡ．．．
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
于淼 方健 李玲玉 潘启华 薛亭 邓羽 陈凯 陈天圣
为进一步分析鱼类干细胞多能性转录因子Oct4的功能,将团头鲂(Megalobrama amblycephala)Oct4进行原核表达并制备了兔抗Oct4多克隆抗体。采用RT-PCR方法从团头鲂卵巢中扩增Oct4基因的部分编码片段,插入载体pET32a中构建重组原核表达载体pET32a-MaOct4;将表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导、Ni(2+)亲和柱层析纯化获得分子量约49 ku的可溶性重组蛋白;以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰兔制备抗体,通过ELISA法测定其效价,We
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
田斌 张昌毅 佘群新 梁运祥
泉古菌Sulfolobus islandicus中PCNA有3个同源类似蛋白,本研究选取PCNA1作为研究对象,为获得可溶性表达的PCNA1蛋白,制备多克隆抗体,深入了解PCNA1基因的功能,将PCNA1基因片段克隆到组氨酸标签融合的表达载体pET30a中,利用IPTG诱导,金属螯合亲和层析进行纯化分析表明,融合蛋白大部分可溶。紫外分光光度法测定纯化蛋白的纯度可达90%以上,浓度约为2 mg/mL。免疫家兔制备多克隆抗体,ELISA检测抗血清效价可达1∶10 000以上,Western印迹检测证明抗体特异性良好。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
郭佳 郁品泽 贾敏 郁飞
[目的]制备乙烯应答基因HLS1多克隆抗体,在过表达植物中检测HLS1的积累,为深入研究HLS1响应乙烯信号通路的分子机制奠定基础。[方法]构建pET28a-HLS1c原核表达载体,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导获得重组蛋白HLS1c-His;镍柱亲和纯化重组蛋白后免疫家兔获得抗HLS1血清,利用抗原亲和纯化抗血清获得高纯度的HLS1多克隆抗体;用HLS1抗体和GFP抗体,检测原生质体瞬时转化体系中GFP-HLS1c融合蛋白的表达;用农杆菌蘸花法获得过表达GFP-HLS1g的转基因植物,用HLS1抗体和GFP抗体检测GFP-HLS1g融合蛋白的表达。[结果]成功构建了原核表达载体pET28a-HLS1c,并在大肠杆菌系统中诱导获得重组蛋白HLS1c-His,且多以包涵体形式存在。纯化的HLS1c-His多克隆抗体,能清晰检测到约80 ng原核表达的HLS1抗原。纯化的HLS1抗体不仅能检测到原生质体中瞬时表达的GFP-HLS1c融合蛋白,也能检测到过表达转基因植物株系中的GFP-HLS1g融合蛋白,并且与标签蛋白GFP对应抗体所检测到的特异性条带大小一致。[结论]成功制备了拟南芥HLS1蛋白多克隆抗体,为HLS1蛋白在植物发育中的功能研究奠定了基础。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
李芳 罗军 许会芬 石恒波 朱江江
【目的】制备高特异性、高效价的乙酰/丙二酸单酰转移酶(MAT)多克隆抗体,为研究山羊MAT在脂肪酸代谢中的功能奠定基础。【方法】采用PCR方法扩增奶山羊的MAT基因,将其亚克隆到pET32a(+)载体得到pET32a(+)-MAT原核表达载体,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。使用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化融合蛋白,纯化的MAT蛋白经复性后进行活性检测。采用皮下免疫法将纯化的MAT蛋白免疫兔子制备多克隆抗体,用ELISA和Western blot检测血清多克隆抗体的效价和特异性。【结果】PCR扩增得到981bp的MAT基因编码区;成功构建了pET32a(+)-MAT原核表达载...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
上官晓庆 张春霞 赵天永
[目的]将玉米异分支酸合成酶1(ZmICS1)及系统获得抗性缺陷1(ZmSARD1)进行原核表达和纯化,并免疫家兔获得多克隆抗体,为深入研究ZmICS1和ZmSARD1在玉米抵抗病原菌胁迫中的功能奠定基础。[方法]克隆玉米ZmICS1和Zm SARD1基因CDS区,连接到原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌表达菌株Rosettgami2(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达His_(×6)-ZmICS1和His_(×6)-ZmSARD1重组蛋白,以透析纯化后的重组蛋白为抗原免疫家兔,制备多克隆抗体,并进行验证和检测。[结果]成功构建了原核表达载体pET-28aZmICS1和pET-28a-ZmSARD1,于37℃、0.84 mmol/L IPTG在大肠杆菌表达菌株Rosett-gami2(DE3)中诱导出His_(×6)-ZmICS1和His×6-ZmSARD1重组蛋白。纯化蛋白免疫家兔,所得ZmICS1抗体能够检测到3 ng的His_(×6)-ZmICS1,ZmSARD1抗体能检测到低至0.3 ng的His_(×6)-ZmSARD,且分别能特异性地检测玉米B73原生质体过表达的ZmICS1和ZmSARD1蛋白。[结论]成功制备了玉米ZmICS1、ZmSARD1多克隆抗体,可用于玉米内源ZmICS1和ZmSARD1蛋白含量的检测。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
褚文辉 张伟 赵海平 王大涛 李春义
为研究梅花鹿Thymosin beta 10基因(Tβ10)在鹿茸快速生长过程中的作用,利用Gateway技术构建梅花鹿Tβ10基因的原核表达载体—pDEST17-Tβ10并诱导表达,对融合蛋白进行功能检测及多克隆抗体制备。结果表明:1)获得了190bp Tβ10基因开放阅读框序列,并获得重组表达载体pDEST17-Tβ10。2)pDEST17-Tβ10在宿主BL21-SI中诱导表达条件为0.3mol/L NaCL诱导2h,获得产物的最终浓度为0.50mg/mL。3)制备的Tβ10蛋白多克隆抗体血清效价在105之上,该抗体可以特异性结合天然和原核表达的Tβ10蛋白。4)离体检测发现,Tβ10融合蛋白一方面可以促进人脐静脉内皮细胞增殖,另一方面可以抑制鹿茸前成软骨区细胞的增殖。综上所述,本研究获得了具有生物活性的Tβ10融合蛋白,并制备了高度特异性的梅花鹿Tβ10蛋白多克隆抗体,为深入研究Tβ10基因的生物学功能奠定了基础。
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