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[期刊] 水产学报
[作者]
罗鹏 胡超群
溶藻弧菌的胞外产物(ECP)在其致病过程中发挥重要作用,已经观察到溶藻弧菌ECP所致的溶血现象,关于溶藻弧菌溶血素的种类和其对溶藻弧菌的致病性贡献的报道非常稀少。利用已经报道的多种弧菌溶血素基因序列设计通用引物,检测溶血素基因在溶藻弧菌中的分布,发现96个菌株中有74株扩增出溶血素基因(vah)片段。对致病株ZJ0451的vah片段测序。根据已测得的片段序列设计引物,通过反向PCR扩增及后续克隆测序获得全长vah基因及部分侧翼序列。经比对证实溶藻弧菌vah与多种弧菌的TLH类溶血素高度相似,且其肽链N端有信号肽。利用pET32a载体构建了两种包含不同长度融合标签的vah表达载体,并均在大肠杆菌...
关键词：
溶藻弧菌 溶血素 反向PCR 表达
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
丁莹 潘迎捷 赵勇 孙晓红 金维荣 徐晓晶 秦红友
根据GenBank上已有的副溶血弧菌耐热直接溶血毒素的基因序列,设计并人工合成引物。将耐热直接溶血毒素的基因全长克隆到大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1上,构建重组表达载体tdhA/pGEX-4T-1和tdhS/pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21(DE3),得到表达的工程菌株。优化诱导表达条件,表达耐热直接溶血毒素。转化有重组质粒tdhA/pGEX-4T-1,tdhS/pGEX-4T-1的BL21可稳定高效地表达可溶形式的目的蛋白。表达产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,用GST琼脂糖珠柱亲和层析纯化。溶血实验表明,表达的蛋白具有溶血活性。
[期刊] 水产学报
[作者]
龚晖 林天龙 俞伏松 董传甫 陈日升 杨金先 陈振海
应用PCR技术,从1株鳗源嗜水气单胞菌ML316中扩增得到β 溶血素基因AHL316HEM,将AHL316HEM克隆到pGEM TEasyVector,经分析验证后重组到pcDNA3.0中,构建了重组质粒PDLH。转化重组质粒PDLH的大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α能在血琼脂培养皿中形成明显的β 溶血斑,重组菌纯化的胞外产物溶血价为1.28×104HU·mg-1,同时重组菌的胞外产物能被原始菌株的高免血清特异性地识别。结果证实,克隆到鳗源嗜水气单胞菌β 溶血素基因,重组质粒PDLH能够表达具有天然生物学活性的β 溶血素,为构建嗜水气单胞菌核酸疫苗奠定了基础。
关键词：
嗜水气单胞菌 β-溶血素基因 克隆 表达
[期刊] 中国水产科学
[作者]
孙婧 孙铂光 贾爱荣 张晓华
坎氏弧菌(Vibrio campbellii)是水产养殖动物的重要致病菌。本研究构建了坎氏弧菌热不稳定溶血素(TLH)基因的重组表达质粒pET26b(+)/tlh,并转入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达带有6个组氨酸的TLH融合蛋白,然后利用Ni琼脂糖亲和层析柱进行纯化。SDS-PAGE分析显示,该溶血素能够大量表达,分子量约为42kD。纯化的TLH(0.41mg/mL)具有较强的溶血活性(溶血圈直径为16mm)及磷脂酶活性(晕圈直径为15mm)。其溶血活力的最适温度为37℃,在75℃下培养30min即丧失活力;最适pH为6,pH大于或小于6时都会导致其稳定性下降;一价金属离子如Na+、K...
[期刊] 水产学报
[作者]
梁海鹰 夏立群 吴灶和 简纪常 鲁义善
参照GenBank上登录的弧菌鞭毛蛋白flaB基因序列设计引物,PCR扩增溶藻弧菌HY9901株的flaB全长基因,序列分析结果显示该基因为1134bp,编码377个氨基酸。与GenBank中其它弧菌的同源基因序列比对显示,溶藻弧菌flaB基因与副溶血弧菌flaB基因的同源性最高(92%)。将该基因定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达出带His-tag的融合蛋白,分子量大小与预期一致。优化的表达条件为28℃,0.4mmol/LIPTG浓度诱导10h。用纯化后的融合蛋白免疫SPF级小鼠,制备了多克隆抗体。Western-blotting结果表明鼠抗...
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
庞欢瑛 薛丽丽 简纪常 蔡双虎 鲁义善 吴灶和
根据已发表的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)血红素结合蛋白(Periplasmic Hemin-Binding Protein,HutB)基因序列设计引物,PCR扩增溶藻弧菌HY9901株的hutB基因,序列分析结果显示该基因全长870 bp,共编码289个氨基酸,分子量约为30.59 ku,PI为6.45。细胞定位、SignalP4.0、TMHMM Server 2.0和SoftB erry-Psite预测结果显示,hutB位于外周质中,存在信号肽切割位点,没有跨膜结构域,氨基酸序列含有1个cA MP和cG MP的蛋白激酶磷酸化位点,4个蛋白激酶C磷酸化位点等多个活性位点...
关键词：
溶藻弧菌 hutB基因 血红素摄取
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
陈春琳 刘祥 俱雄
【目的】构建溶藻弧菌外膜蛋白OmpK原核表达载体,优化OmpK蛋白的诱导表达条件,制备OmpK蛋白小鼠多克隆抗体。【方法】通过PCR扩增获得ompK基因,连接pET-32a质粒构建OmpK-pET32a载体,将其转化大肠杆菌BL21后进行诱导表达。利用切胶纯化获得OmpK蛋白后,免疫小鼠制备OmpK蛋白多克隆抗体,采用ELISA法检测抗体效价,Western-Blotting法检测抗血清特异性。通过正交试验,获得OmpK菌株的最佳诱导表达条件与培养条件。【结果】PCR扩增获得了长816bp的ompK基因;成功构建了OmpK-pET32a载体,其诱导表达产物分子质量为30ku,与预期结果一致。E...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
陈吉祥 杨慧 颜显辉 钟英斌 张晓华 李筠
从山东沿海的发病鲈鱼(Lateolabrax japonicus)分离到1株致病性哈维氏弧菌(Vibrio harveyi),从该菌的染色体DNA扩增出一条长约1.4 kb的特异性片段。DNA序列分析表明,该克隆片段含有完整的1 254 bp溶血素基因,该溶血素基因与哈维氏弧菌VIB645的溶血素基因VhhA和VhhB的相似性分别为99.0%和98.5%;与副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)热稳定性溶血素基因(TDH)的相似性为74.5%;与拟态弧菌(V.mimicus)、创伤弧菌(V.vulnificus)、霍乱弧菌(V.cholerae)磷脂酶基因的序列相似性分别为57.4...
关键词：
哈维氏弧菌 溶血素 基因克隆 海水环境
[期刊] 中国农业科学
[作者]
杨钦 王长法 杨宏军 杨少华 高运东 仲跻峰 彭广能
【目的】实现牛乳中金黄色葡萄球菌β-溶血素在大肠杆菌中的高效表达,并分析重组β-溶血素的溶血活性。【方法】PCR扩增牛乳中金黄色葡萄球菌山东分离株β-溶血素基因,构建原核表达载体pET32a+/hlb,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,用96孔血凝板测定重组蛋白的溶血效价,以血琼脂平板法检测重组蛋白的CAMP反应。【结果】测序结果表明,扩增片段含有993bp的ORF,可编码含330个氨基酸的成熟蛋白;SDS-PAGE分析重组蛋白表达水平,IPTG诱导后表达的融合蛋白分子量为57kD,表达量占菌体总蛋白的23.9%;溶血效价分析,金葡菌β-溶血素对绵羊红细胞的溶血效价为278HU·mg-...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
朱忠珂 王建华 汪儆 张春雷 蔡青和
为了探讨重组犬溶菌酶的活性及临床应用前景,人工合成犬溶菌酶基因,构建其原核重组表达载体pPROHTa-rcLYZ,进行原核表达并对表达产物进行活性分析。结果表明,合成的犬溶菌酶基因全长396 bp,编码132 aa;构建的表达载体pPROHTa-rcLYZ含有犬溶菌基因完整的ORF;重组犬溶菌酶的相对分子质量为16 ku;重组犬溶菌酶约占全菌总蛋白32％,纯化后占全菌可溶性蛋白的95％;重组犬溶菌酶最适pH值为6．2,最适温度为38℃,对溶壁微球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌有较强的溶菌活力,对铜绿假单胞菌、链球菌、枯草杆菌等有一定的抑制作用,对白色念珠菌无抑制作用,对人工感染的犬大肠...
关键词：
犬溶菌酶基因 犬溶菌酶 原核表达
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张艳艳 刘小林 黄海洪 钱昭英 王宪宗 相建海 李义军
【目的】研究凡纳滨对虾Crustin-like基因(即CL基因)的结构和功能,探明CL基因是否参与副溶血弧菌侵染条件下的免疫应答,为进一步研究凡纳滨对虾的免疫机制和抗病育种奠定基础。【方法】采用RT-PCR技术克隆凡纳滨对虾CL基因;用DNAstar、Clustalx、MEGA 5.0、PROSITE、TMpred和SignalP软件,分析CL基因序列及其蛋白结构,并预测蛋白功能;利用副溶血弧菌进行攻毒试验和实时定量PCR,检测CL基因在病原侵染条件下的表达情况。【结果】克隆获得了凡纳滨对虾CL基因(登录号:JQ824114)的cDNA,全长为501bp,含有33bp的5′非翻译区(1～33b...
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘代新 宁喜斌
运用PCR技术成功建立了检测产耐热直接相关溶血素(TRH)的副溶血性弧菌的方法,并应用该方法从1株标准株和其他3种不同来源的37株副溶血性弧菌中的13株扩增出0.5 kb的trh基因特异性扩增带;产TRH的副溶血性弧菌中1株标准株,12株分离自腹泻病人排泄物或呕吐物,1株分离自水产动物养殖用水;并且产TRH与尿素酶阳性的副溶血性弧菌菌株之间的具有一一对应的关系,结果认定尿素酶阳性是产TRH的副溶血性弧菌菌株的表现型。
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘祥
为构建水产致病菌溶藻弧菌附着定植因子ACFA原核表达载体,优化ACFA蛋白的诱导表达条件,制备ACFA蛋白小鼠多克隆抗体。通过分子克隆获得ACFA蛋白的表达菌株,利用切胶纯化获得ACFA蛋白,免疫小鼠制备多克隆抗体,采用ELISA法检测抗体滴度为1∶3 200倍,Western-Blotting法检测抗血清特异性较好。通过正交试验,获得ACFA菌株的最佳表达条件为:诱导时菌液OD600值0.5,加IPTG终浓度0.3 mmol/L,诱导时间8 h,诱导温度32℃;最佳培养条件为:葡萄糖浓度0,转速230 r/min,装液量50 m L。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
杜娜 顾泽茂 袁军法 林蠡 翟艳花 刘学芹 罗宇良
根据GenBank中致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)气溶素(aerolysin,Aer)基因的序列设计引物,以来自湖北的鱼源A.hydrophila分离株为模板扩增出aer基因的ORF序列,克隆到pMD18-T载体上进行序列测定。测序结果表明,A.hydrophila的aer基因的系统进化树中国内菌株聚为一支,国外菌株聚为一支。通过pET-32a(+)载体构建Ah15株aer基因的表达载体pET32a-15,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行诱导表达,通过SDS-PAGE分析,显示与预期大小约72.2ku相吻合的融合蛋白带,且以包涵体形式存在。浓缩后的...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
王蓓 李桂欢 王培 汤菊芬 鲁义善 吴灶和 简纪常
为研究罗非鱼源无乳链球菌溶血素(Hemolysin,Hly)对鱼体的免疫保护作用,根据已获得的无乳链球菌ZQ0910全基因组序列设计引物扩增hly基因,定向克隆于原核表达载体p ET-28a中,构建原核重组质粒p ET-28a-hly,经IPTG诱导表达后,制成亚单位疫苗免疫吉富罗非鱼,并分析疫苗的免疫保护力。结果显示,hly基因产物大小1335 bp,编码444个氨基酸,经测序与Gen Bank报道的链球菌属Hly氨基酸序列同源性可达99%。经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析可见一条51.7 k D的特异条带;Western blotting分析结果说明表达的Hly蛋白能与His-T...
关键词：
无乳链球菌 溶血素 原核表达 免疫原性
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