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[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
陈春琳 刘祥 俱雄
【目的】构建溶藻弧菌外膜蛋白OmpK原核表达载体,优化OmpK蛋白的诱导表达条件,制备OmpK蛋白小鼠多克隆抗体。【方法】通过PCR扩增获得ompK基因,连接pET-32a质粒构建OmpK-pET32a载体,将其转化大肠杆菌BL21后进行诱导表达。利用切胶纯化获得OmpK蛋白后,免疫小鼠制备OmpK蛋白多克隆抗体,采用ELISA法检测抗体效价,Western-Blotting法检测抗血清特异性。通过正交试验,获得OmpK菌株的最佳诱导表达条件与培养条件。【结果】PCR扩增获得了长816bp的ompK基因;成功构建了OmpK-pET32a载体,其诱导表达产物分子质量为30ku,与预期结果一致。E...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
刘祥
Ｏｍｐ Ｕ蛋白为溶藻弧菌主要外膜蛋白，具有很好的免疫原性，在疫苗上有很好的应用前景。本试验通过分子克隆获得Ｏｍｐ Ｕ蛋白的表达菌株，利用切胶纯化获得Ｏｍｐ Ｕ蛋白，免疫小鼠制备多克隆抗体，采用ＥＬＩＳＡ法检测抗体滴度为１∶３２００倍，ＷＥＳｔＥｒｎＢＬＯｔｔＩｎｇ法检测抗血清特异性较好。通过正交试验，获得Ｏｍｐ Ｕ菌株的最佳表达条件为：诱导时菌液ＯＤ６００值１，加Ｉｐｔｇ终浓度０．１ｍｍＯＬ／Ｌ，诱导时间８ ｈ，温度３２℃；最佳培养条件为：葡萄糖浓度０．４％，转速２３０ ｒ／ｍＩｎ，装液量５０ ｍ Ｌ。为Ｏｍｐ Ｕ工业发酵、蛋白功能与疫苗开发研究奠定基础。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
刘祥 俱雄 陈春琳
通过分子克隆,获得了Omp T蛋白的表达菌株;利用切胶纯化,获得了Omp T蛋白。用Omp T蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,采用ELISA法检测抗体滴度为1∶1 600,用Western Blotting法检测抗血清特异性较好。采用正交试验,获得Omp T菌株的适宜表达条件为诱导菌液OD600 nm为1.0,IPTG添加终浓度为0.3 mmol/L,诱导时间为8 h,诱导温度32℃;适宜培养条件为葡萄糖质量分数0%,转速230 r/min,装液量50 m L。
[期刊] 水产学报
[作者]
张崇文 于涟 毛芝娟 褚武英 钱荣华
根据哈维氏弧菌外膜蛋白OmpK的基因序列设计一对引物,应用聚合酶链式反应(PCR)方法,从分离自患病大黄鱼的哈维氏弧菌基因组中扩增获得一段约800bp的序列。将其克隆到pGEMTeasy载体,测序结果证明该序列是哈维氏弧菌外膜蛋白OmpK基因。用PCR方法去除其信号肽序列,定向克隆到原核表达载体pGEX4T2构建重组表达质粒pGEX4TOmpK。IPTG诱导后能够在大肠杆菌BL21中高效表达分子量约为53kD的GSTOmpK融合蛋白。用纯化后的融合蛋白免疫新西兰兔获得了高效价的抗血清。Westernblotting分析表明,它与从哈维氏弧菌中提取的约27kD的外膜蛋白能够发生特异反应,提示外膜...
关键词：
哈维氏弧菌 外膜蛋白 OmpK 原核表达
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘祥
为构建水产致病菌溶藻弧菌附着定植因子ACFA原核表达载体,优化ACFA蛋白的诱导表达条件,制备ACFA蛋白小鼠多克隆抗体。通过分子克隆获得ACFA蛋白的表达菌株,利用切胶纯化获得ACFA蛋白,免疫小鼠制备多克隆抗体,采用ELISA法检测抗体滴度为1∶3 200倍,Western-Blotting法检测抗血清特异性较好。通过正交试验,获得ACFA菌株的最佳表达条件为:诱导时菌液OD600值0.5,加IPTG终浓度0.3 mmol/L,诱导时间8 h,诱导温度32℃;最佳培养条件为:葡萄糖浓度0,转速230 r/min,装液量50 m L。
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘祥
为构建小鼠BMP3蛋白原核表达载体,纯化BMP3蛋白,制备并鉴定BMP3蛋白小鼠多克隆抗体,以及对BMP3进行系统进化关系研究。采用RT-PCR方法从小鼠肝脏中克隆获得BMP3蛋白的表达菌株;利用SDS-PAGE电泳切胶纯化、尿素梯度复性获得BMP3蛋白,免疫小鼠制备BMP3蛋白多克隆抗体;采用ELISA法检测抗体滴度达1∶3 200倍,Western Blotting证实抗血清具有很好的特异性。通过DNAMAN软件对BMP3序列同源性分析发现其C-端在不同动物间存在较高同源性;MEGA软件对BMP3序列的系统发生分析证实BMP3在动物间具有明显的进化趋势。为BMP3蛋白调控骨代谢及与肿瘤的关...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
张艳维 张永安 涂加钢
为研究L蛋白在乌鳢水泡病毒(snakehead vesiculovirus, SHVV)增殖过程中发挥的作用,扩增SHVV L基因的前900个碱基,将其克隆到载体pET-32a(+)中,构建原核表达质粒pET32a-L,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。设置不同温度、IPTG浓度及诱导时间,选择最佳的表达条件。通过NI-NTA亲和层析柱纯化蛋白,并利用纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。用Western blot鉴定抗体特异性,间接免疫荧光观察L蛋白在SHVV感染斑点叉尾鮰卵巢细胞(channel catfish ovary, CCO)中的定位情况。结果显示,纯化的L蛋白分子质量约42 ku,与预期大小相符。制备的L蛋白多克隆抗体可以与L蛋白发生特异性免疫反应,且L蛋白主要定位在细胞质,表明L蛋白多克隆抗体制备成功。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
马跃 王建珏 黄江涛 张天颖 史怀平
【目的】原核表达奶山羊表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)蛋白胞外区25-644位共620个氨基酸序列(ECD序列),纯化蛋白并免疫家兔,制备针对山羊EGFR蛋白的特异性多克隆抗体,为山羊EGFR蛋白功能研究奠定基础。【方法】以pMD19-T-EGFR为模板,采用PCR方法扩增得到EGFR胞外区(ECD)基因序列。将ECD序列连接pET-32a(+)质粒构建pET-32a(+)-ECD原核表达载体,将该重组载体导入大肠杆菌BL21(DE3)中并诱导
[期刊] 淡水渔业
[作者]
李常健 蒋琼凤
采用SDS-PAGE分离纯化彩鲫(Carassius auratus gibelio)ran基因编码区cDNA全长序列的原核表达蛋白,并以此为抗原免疫家兔,制备了相应的多克隆抗体;W estern b lotting结果表明,该抗体效价为1∶1000,具有较高的特异性。并从抗原蛋白相对分子质量、每次注射蛋白量、注射方式、注射途径等诸方面对该技术的要点进行了介绍。
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
陈媛 屈贵蜀 彭尧舜 许丽惠 王全溪
根据FAdV-4 NP株F1蛋白编码框的主要抗原位点,设计一对特异性引物,经PCR扩增、测序,分析表达效率后,进行密码子优化;以合成的新序列作为模板,构建重组表达质粒pET-32a-F1,将质粒转化到BL21中,筛选诱导条件,Western blot鉴定表达产物;将待纯化蛋白依次经过不同浓度的咪唑洗脱,纯化重组蛋白;最后将纯化后的蛋白免疫新西兰黄兔,收集血清并用间接ELISA法测定抗体效价.结果表明,所设计的特异性引物扩增了一条约699 bp的片段.PCR验证和酶切鉴定表明,pET-32a-F1被成功构建,并能够高效表达.重组质粒pET-32a-F1诱导的最佳IPTG浓度为0.3 mmol·L~(-1),最佳诱导时间为5 h,最佳诱导温度为37℃;咪唑洗脱浓度为80 mmol·L~(-1)时,能获得较单一的洗脱蛋白.此外,本试验制备的F1多克隆抗体的效价可达1∶1 024 000.
[期刊] 中国农业科学
[作者]
徐秋芳 陈晴晴 倪海平 李硕 张金凤 周益军
【目的】通过筛选灰飞虱cDNA酵母表达文库发现原肌球蛋白(tropomyosin,Tm)能与水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)P10蛋白发生互作。研究旨在克隆灰飞虱原肌球蛋白基因(Tm),将其在原核细胞中进行表达,纯化Tm蛋白,免疫大白兔并制备其多克隆抗体,为进一步分析Tm在灰飞虱与RBSDV互作过程中的作用提供抗体条件。【方法】根据与之高度同源的Tm基因信息确定灰飞虱Tm的开放阅读框(open reading frame,ORF)。提取灰飞虱总RNA,采用RT-PCR方法从灰飞虱中克隆Tm的ORF,连接至pMD-18T载体后进行测序...
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘祥
对溶藻弧菌外膜蛋白ＯｍｐＵ进行分子克隆构建，抗原性生物信息学分析，为疫苗的开发奠定了基础。通过分子克隆获得ＯｍｐＵ蛋白的原核表达菌株，重组表达后利用切胶纯化获得ＯｍｐＵ蛋白，免疫小鼠制备抗血清，Ｗｅｓｔｅｒｎ ＢｌＯｔｔｉｎｇ检测发现ＯｍｐＵ蛋白具有很好的抗原性。采用在线软件预测ＯｍｐＵ为亲水的分泌型蛋白；存在多个酶切位点。采用ｔｍＨｍｍ ｓｅｒｖｅｒ ｖ．２．０程序预测ＯｍｐＵ无跨膜结构并定位于细胞膜外。通过ｓｉｇｎａｌ ｐ ４．１软件分析发现ＯｍｐＵ的１～２１位氨基酸为信号肽序列。ｓＯｐｍａ服务器预测ＯｍｐＵ的二级结构含无规则卷曲２７．９４％，α－螺旋为３３．２４％，β－转角为１０．２９％．．．
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王玥 梁爽 梁慧珂 郁飞 齐亚飞
【目的】将拟南芥叶绿体发育必需蛋白ＰＡＣ进行大肠杆菌原核表达和纯化，并免疫家兔，获得针对ＰＡＣ蛋白的多克隆特异性抗体，为进一步研究ＰＡＣ蛋白在叶绿体发育中的功能提供保证。【方法】将编码拟南芥ＰＡＣ蛋白的ＣＤＮＡ克隆至原核表达载体ＰＥＴ－２８Ａ中，转化ＢＬ２１（ＤＥ３）表达菌，经ＩＰＴＧ诱导后，对诱导产生的ＰＡＣ蛋白进行镍柱亲和纯化和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ割胶纯化，并将纯化的ＰＡＣ蛋白通过皮下注射免疫家兔，利用分离得到的抗血清，针对拟南芥野生型、ＰＡＣ敲除突变系ＰＡＣ－１和ＰＡＣ过表达系ＰＡＣＯＥ的总蛋白进行免疫印迹检测。【结果】成功构建了拟南芥基因ＰＡＣ的原核表达载体ＰＥＴ－２８Ａ－ＰＡＣ，在３７℃．．．
关键词：
叶绿体 PAC蛋白 原核表达 抗体制备
[期刊] 海洋渔业
[作者]
刘晓玲 王振东 孙涵甜 王振华 赵振军 李忌
以栉孔扇贝(Chlamys farreri)卵巢cDNA为模板,采用PCR扩增Foxl2(forkhead box l2)基因,通过双酶切与pET-28a构建重组质粒表达载体,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,筛选鉴定阳性克隆,经测序鉴定后提取质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21,以IPTG诱导Foxl2蛋白表达,用SDS-PAGE鉴定表达情况,经镍柱纯化表达蛋白,通过免疫新西兰白兔(New Zealand white rabbits)制备多克隆抗体,以ELISA测定抗体效价,最后用WB(Western Blot)检测抗体特异性。结果表明,重组载体转化BL21后经1.0 mmol L~(-1)IPTG于37℃诱导6 h可产生大量Foxl2蛋白,主要以包涵体形式表达。经镍柱柱纯化可得到纯度较高的Foxl2蛋白,浓度达800 ug·mL~(-1)。免疫新西兰白兔获得多克隆抗体,效价大于1∶128 000。WB检测显示:该抗体能特异识别扇贝卵巢中的Foxl2蛋白,同时发现Foxl2蛋白在卵巢中强表达,而在精巢中几乎不表达,揭示栉孔扇贝中该蛋白具雌性性别相关性。研究成功获得效价高且能特异识别天然Foxl2的多克隆抗体,为后续深入研究Foxl2在栉孔扇贝卵巢中的功能提供了分子工具。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
廖健淇 谢芝勋 张民秀 张艳芳 罗思思 李孟 谢志勤 谢丽基 邓显文 范晴 曾婷婷 黄娇玲 王盛
【目的】原核表达鸡细小病毒（ChPV）的NS1和VP2蛋白，制备其多克隆抗体，为深入探究ChPV蛋白结构功能及建立血清学诊断方法提供物质基础。【方法】通过合成ChPV GX-Ch-PV-21毒株的NS1和VP2蛋白基因序列，构建原核重组表达载体pET-32a-NS1和pET-32a-VP2，将测序正确的重组质粒转化至大肠杆菌transsetta感受态细胞进行原核表达，优化表达条件，以十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳和免疫印迹（Western-blotting）方法鉴定NS1和VP2蛋白的表达情况。将表达产物免疫无特定病原体（SPF）鸡获得多克隆抗体，采用酶联免疫吸附实验(ELISA)方法测定其效价，以Western-blotting和间接免疫荧光试验(IFA)对多克隆抗体进行鉴定。【结果】SDS-PAGE分析结果显示，NS1和VP2蛋白条带大小分别约为104.0和87.0 kD，与预期条带大小相符。对重组质粒pET-32a-VP2和pET-32a-NS1进行最佳诱导条件筛选，结果显示NS1蛋白表达的最佳诱导条件为异丙基-beta-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）终浓度1.0 mmol/mL，16 ℃诱导表达过夜；VP2蛋白表达的最佳诱导条件为IPTG终浓度0.8 mmol/mL，20 ℃诱导表达过夜。可溶性分析结果显示，NS1和VP2蛋白主要以包涵体形式存在；间接ELISA检测NS1和VP2蛋白的多克隆抗体效价均为1︰10240000；Western-blotting鉴定结果表明，His标签蛋白和相对应的鸡多克隆抗体均能与NS1和VP2蛋白特异性结合；IFA分析结果显示，VP2和NS1蛋白多克隆抗体均能与ChPV特异性结合。【结论】成功表达ChPV的NS1和VP2蛋白和制备的鸡多克隆抗体，可作为深入探究ChPV蛋白结构功能及建立ChPV血清学诊断方法的基础材料。
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