[目的]本文旨在研究 lncRNA-269序列特征、表达模式和转录调控，为后续开展lncRNA-269的功能研究提供理论基础。[方法]以湖羊为研究对象，采用5'/3' RACE结合PCR扩增方法获得其序列全长，利用RT-qPCR方法鉴定其在湖羊组织中的表达模式，并利用PCR方法扩增其启动子区，鉴定其启动子区特征，分析其转录调控情况。[结果]湖羊lncRNA-269全长3 146 bp，组织表达谱显示其在湖羊各组织中广泛表达，且在健康卵泡中显著高表达， 其表达水平与NR5A1 mRNA水平和血清中E_(2)水平呈正相关。荧光素酶活性分析发现在其启动子区的-359 nt ～ -17 nt之间有一个转录激活基序，在-1 485 nt ～ -941 nt之间有一个转录抑制基序。JASPAR软件预测发现在lncRNA-269转录抑制启动子区域存在FOXO3、PDX1等转录因子结合位点，在转录激活区域有SMAD4、YY1等转录因子结合位点。过表达SMAD4可显著提升lncRNA-269启动子区荧光素酶活性，染色质免疫沉淀（ChIP）试验进一步确认了SMAD4特异性与lncRNA-269启动子区结合。[结论]湖羊lncRNA-269在健康卵泡中显著高表达，其启动子区存在一个转录激活区域和一个转录抑制区域，转录因子SMAD4可通过与lncRNA-269启动子区结合显著上调lncRNA-269的启动子活性。

[目的]本文旨在探究长链非编码RNA（long no-coding RNA，lncRNA）MSTRG.96141.1转录本表达特征及参与湖羊卵巢颗粒细胞凋亡（granulosa cell，GC）的调控机制。[方法]挖掘课题组前期高低繁湖羊(高繁，High prolificacy Fec^BB，HPBB；低繁，Low Prolificacy Fec^BB，LPBB)健康优势卵泡（> 5 mm）全转录组测序数据，鉴定到差异miR-3957-3p，采用生物信息学、双荧光素酶报告等方法确定与miR-3957-3p存在靶向关系的lncRNA；在此基础上，以湖羊GC为模型，采用过表达/干扰、qRT-PCR、FSIH、细胞流式术等技术，分析其表达特征和对湖羊GC凋亡的影响。[结果]miR-3957-3p表达水平HPBB组显著低于LPBB组；lncRNA（MSTRG.96141.1）与miR-3957-3p存在靶向关系；该转录本在湖羊生殖器官中的卵巢上表达最高，HPBB组显著高于LPBB组；进一步在湖羊卵巢GC中检测到该转录本的阳性信号，且定位于GC细胞质；干扰MSTRG.96141.1上调BAX基因mRNA表达水平和BAX:Bcl-2比率，进而促进湖羊GC凋亡；过表达miR-3957-3p上调BAX基因mRNA表达水平和BAX:Bcl-2比率，下调Bcl-2基因mRNA表达水平，进而促进湖羊GC凋亡；干扰miR-3957-3p则与之相反。[结论]MSTRG.96141.1通过吸附miR-3957-3p参与调控湖羊GC凋亡，进而影响卵泡发育。而MSTRG.96141.1能否作为湖羊繁殖力的分子标记，还需要进一步探究。

[目的]探究lncRNA-NAS对湖羊睾丸间质细胞（LCs）睾酮分泌的影响。[方法]首先利用qRT-PCR对湖羊lncRNA-NAS进行组织表达谱分析；然后利用ELISA、Western blot、CCK-8、qRT-PCR等技术分析其干扰lncRNA-NAS对睾丸间质细胞睾酮分泌、细胞增殖和凋亡的影响；并在前期测序结果上对lncRNA-NAS可能作用的靶基因进行分析。[结果]lncRNA-NAS在湖羊心脏、肝、脾、肾、空肠、睾丸组织中均有表达，但其在睾丸中的表达量显著高于其它组织（P0.05）；相比对照组，干扰lncRNA-NAS后，睾丸间质细胞中睾酮分泌水平显著升高（P<0.05），睾酮分泌相关基因和蛋白表达量显著升高（P<0.05），细胞增殖活力增强（P<0.05）；通过分析lncRNA-NAS潜在的9个靶基因，其中有2个为未知基因，后续针对7个已知基因进行研究，当lncRNA-NAS干扰后，发现只有生殖细胞发育相关基因Nanos3表达水平发生变化，表现为显著升高（P<0.05），结果提示其可能为lncRNA-NAS作用的靶基因Nanos3。[结论]lncRNA-NAS可能通过调控靶基因Nanos3影响湖羊睾丸间质细胞睾酮的分泌。

繁殖力是影响养羊业经济效益的重要指标之一，而繁殖性状遗传力低、周期长、选育进展慢。湖羊作为我国著名的绵羊品种，以“全年发情、多胎”而著称，是当前国内绵羊杂交育种和肉羊生产最重要的母本品种，也是研究家畜高繁机制的理想模型。繁殖性状是一个极其复杂的性状，受遗传、表观修饰、激素和营养等多因素调控，本文主要从下丘脑-垂体-性腺轴及子宫的分子调控和卵泡、子宫及胎盘发育的营养调控2个层面综述了湖羊繁殖性状调控机制的研究进展；同时指出了当前以湖羊作为多胎种质资源研究存在的问题并就未来研究方向进行了展望。

分析了１６头湖羊种公羊的５４８个女儿共计２６３１胎产羔记录，发现母羊每胎产羔数为１～５只的比例分别为１５．１７％，４５．７６％，３２．１５％，６．０８％及０．８４％。对不同胎次的产羔数作方差分析，结果表明，胎次间存在着显著差异。每胎产羔数与胎次的关系为：ｙ＝１．７６４８＋０．２８６０ｘ－０．０２６７ｘ２，复相关指数为Ｒ２＝０．９９９６。依据该回归方程计算出每胎产羔估计值，并以４，５，６，７胎的校正产羔值的简单平均数为基准，计算了各胎次的校正系数。应用次级样本含量不等的两因子最小二乘方差分析法估计种公羊的产羔效应值，表明种公羊间存在着繁殖性能方面的差异。

【目的】筛选出辽宁绒山羊皮肤成纤维细胞中与绒毛生长相关的LncRNA,为绒毛生长相关LncRNA的功能及机制研究提供基础性数据。【方法】提取MT和FGF5处理的辽宁绒山羊皮肤成纤维细胞总RNA,通过样品总RNA电泳检测、测序数据质量评估、Mapping比对、样品间相关性检查对提取的总RNA进行质量检测。筛选出差异表达的LncRNA并预测其靶基因,通过GO和KEGG富集分析,筛选出与绒毛生长相关的LncRNA,并通过Real-time PCR对目标LncRNA进行表达验证。【结果】(1)样品总RNA质量检测结果显示:RNA完整性良好、GC含量相对较高,序列较稳定、样品间表达水平相关性均较高、符合测序要求。(2)差异表达LncRNA的筛选结果显示:1.0g·L~(-1) 24h组差异表达LncRNA有32个,其中4个表达上调,28个表达下调;0.2g·L~(-1) 24h组差异表达LncRNA有10个,其中4个表达上调,6个表达下调;0.2g·L~(-1) 72h组差异表达LncRNA有113个,其中5个表达上调,108个表达下调。10~(-4) g·L~(-1) 24 h组差异表达LncRNA有164个,其中有70个上调,94个下调;10~(-4)g·L~(-1) 72 h差异表达LncRNA有189个,其中有78个上调,111个下调;10~(-6) g·L~(-1) 24 h组差异表达的LncRNA有123个,其中有27个上调,96个下调。(3)靶基因GO富集分析结果显示:1.0g·L~(-1) 24h组差异表达LncRNA靶基因富集在GO的negative regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter;0.2g·L~(-1) 24h组无差异表达LncRNA靶基因富集的GO term;0.2g·L~(-1) 72h组差异表达LncRNA靶基因富集在GO的cellular metabolicprocess biological_process,binding molecular_function,FGF5处理组中只有10~(-4) g·L~(-1) 72 h组差异表达LncRNA靶基因富集在cell cellular_component、cell part cellular_component、intracellular cellular_component、binding molecular_function等6个条目。(4)靶基因KEGG富集分析结果显示:1.0g·L~(-1) 24h组差异表达LncRNA靶基因富集在Steroid biosynthesis pathway;0.2g·L~(-1) 24h组无差异表达LncRNA靶基因富集的Pathway term;0.2g·L~(-1) 72h组差异表达LncRNA靶基因富集在Cell cycle,DNA replication,Steroid biosynthesis,TNF,Nod-likereceptor,NF-kappa B等信号通路,其中TNF和NF-kappa B信号通路与绒毛生长相关。FGF5处理组中,10~(-4) g·L~(-1)72 h组差异表达的LncRNA靶基因显著富集到Fanconi anemia pathway,Huntington’s disease,Metabolic pathway,Aminoacyl-tRNA biosynthesis等9个pathway term,其中Metabolic信号通路与绒毛生长相关;10~(-4) g·L~(-1) 24 h组差异表达的LncRNA靶基因无显著富集的pathway term;10~(-6) g·L~(-1) 24 h组差异表达的LncRNA靶基因只富集在Taste transduction pathway。(5)NF-κB和TNF两个信号通路中富集的靶基因TNFα、TNFAIP3(A20)、NFKBIA(IkBα)、NFKB2、IL8所对应的LncRNA有2个,分别为(Gene ID):XLOC_005914;XLOC_018763;Metabolic信号通路中靶基因所对应的LncRNA有4个,分别为(Gene ID):XLOC_011424、XLOC_009522、XLOC_009063、XLOC_01115。Real-time PCR结果显示:LncRNA XLOC_011424、XLOC_011157、LncRNA XLOC_005914和XLOC_018763与高通量测序结果一致。【结论】LncRNA XLOC_011424、XLOC_011157、LncRNA XLOC_005914和XLOC_018763可能通过调控与绒毛生长相关的NF-κB、TNF或Metabolic信号通路,提高羊绒密度和长度,进而提高辽宁绒山羊绒产量及品质。

性别异形在动物界广泛存在，长期以来一直是生物学中的热门话题。黄喉拟水龟性别分化属温度依赖型，其温度响应分子机制仍不清楚。为了进一步解析龟鳖动物性别分化的分子机制，本研究初步比较分析了黄喉拟水龟转录本中性别差异表达(different expressed, DE)的长链非编码RNA(long noncoding RNA, lncRNA)及其调控的靶基因。首先，运用Illumina深度测序平台，通过转录组测序(RNA-Seqs)对黄喉拟水龟的精巢和卵巢进行了比较转录组学分析并筛选鉴定出雌雄差异转录本，共筛选获得8 237个DE mRNA和9 573个DE lncRNA。通过基因本体论(Gene Ontology, GO)功能注释及京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路富集分析，发现了这些差异转录本主要参与龟鳖动物性别分化和性腺发育等相关信号通路。此外，通过顺式和反式作用分析，筛选获得了一系列与生殖发育相关的（性腺发育和性别分化）受DE lncRNAs调控的靶基因。本研究为进一步阐明黄喉拟水龟温度依赖型性别的分子机制提供了线索，特别是为进一步挖掘利用龟鳖动物性别决定因子，进行龟鳖动物性控育种技术研究奠定了基础。

【目的】通过筛选对大肠杆菌(E.coli)F17菌毛非腹泻型与腹泻型的绵羊脾脏中差异表达的lncRNA,来探究lncRNA对绵羊抗腹泻的作用。【方法】本研究通过对湖羊羔羊口服E.coli F17菌株获得非腹泻和腹泻型个体,利用羔羊肠道细菌计数、病理组织切片验证攻毒成功性;构建非腹泻组和腹泻组羔羊脾脏的cDNA文库,使用Illumina HiSeq 2500平台进行配对测序;通过Gene Ontology(GO)和KEGG Pathway富集分析对差异表达转录本功能描述和细胞通路分析,利用FPKM法估计lncRNA和mRNA转录物的表达水平,并用高通量测序技术RNA-seq筛选出非腹泻和腹泻个体脾脏中的差异表达lncRNA;然后利用荧光定量PCR技术检测了非腹泻组和腹泻组羔羊脾脏组织中DE lncRNA和DE mRNA的表达水平,来验证筛选的DE lncRNA在非腹泻组过程中发挥作用。【结果】羔羊口服E.coli F17菌株后,出现非腹泻和腹泻两种表型,腹泻组羔羊肠道中的细菌数量显著高于非腹泻组(P

【目的】前期研究证实linc-NORFA作为母猪繁殖性状候选基因参与调控卵泡闭锁与卵泡颗粒细胞凋亡过程,进一步鉴定二花脸猪linc-NORFA核心启动子并分析其转录调控机制,为解析linc-NORFA介导猪卵泡闭锁的分子机制奠定理论基础并提供新的研究思路。【方法】采集二花脸猪耳组织样品并提取基因组DNA,利用PCR扩增和测序技术获得二花脸猪linc-NORFA5′调控区序列;通过构建缺失表达荧光报告载体并利用荧光素酶活性试验鉴定二花脸猪linc-NORFA核心启动子;利用生物信息学分析二花脸猪linc-NORFA核心启动子区序列特征与潜在的转录因子结合位点;构建猪FOXO1真核生物表达载体并进一步采用Western blot、qRT-PCR以及荧光素酶活性试验分析转录因子FOXO1过表达对二花脸猪linc-NORFA转录的影响;利用染色质免疫沉淀(ChIP)技术鉴定转录因子FOXO1与二花脸猪linc-NORFA核心启动子区的结合能力。【结果】通过克隆测序与序列拼接共获得二花脸猪linc-NORFA 5′调控区序列1 734 bp,其中包含两个潜在的CpG岛;利用荧光素酶活性试验证实linc-NORFA核心启动子位于-988—-684 bp(转录起始位点作为+1),生物信息学分析表明二花脸猪linc-NORFA核心启动子上包含多个转录因子的结合元件,例如ESR2、FOXO1、E2F1、BRCA1以及NFIC等;另外,ChIP试验还证实在猪卵巢颗粒细胞中FOXO1作为转录因子直接靶向结合在linc-NORFA的核心启动子区;进一步通过试验证实FOXO1过表达可显著下调linc-NORFA核心启动子区活性(P<0.01),同时显著抑制体外培养的猪卵巢颗粒细胞中linc-NORFA的表达(P<0.01)。【结论】鉴定了二花脸猪linc-NORFA核心启动子区,同时证实FOXO1作为转录因子能够与linc-NORFA核心启动子区特异性结合,进而抑制后者的转录活性与表达。研究结果对探究linc-NORFA在猪卵泡闭锁过程中显著下调的分子机制具有重要意义。

【目的】MYB（V-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog）转录因子MoIsw2对稻瘟病菌的生长发育和致病性至关重要。为了深入理解MoIsw2的作用机制，对其调控的稻瘟病菌基因进行鉴定和功能分析。【方法】对野生型稻瘟病菌菌株Ku80和突变体ΔMoisw2进行RNA-seq分析，选择突变体中表达发生明显变化的7个基因（MoEGH16L1、MoEGH16L2、MoSTART1、MoGH61A、MoCTR1、MoFRO1和MoGH31A）作为MoIsw2的候选调控基因，通过基因敲除对其表型和致病性进行分析。【结果】RNA-seq分析表明，突变体ΔMoisw2中差异表达的基因主要涉及氧化还原、细胞膜合成、氨基酸代谢和基因组DNA修复等过程。7个候选调控基因的敲除试验表明，这些基因在稻瘟病菌的营养生长、孢子发育和致病过程中发挥重要作用，各基因突变体表型与突变体ΔMoisw2均具有相似之处。【结论】MoIsw2通过调控多个靶基因参与稻瘟病菌的生长发育和致病过程。

为分析绒山羊皮肤中受Hippo信号通路调控的绒生长候选基因集，本研究选取6只罕山白绒山羊随机分为对照组和褪黑素处理组，每组设3个重复。以自然年为试验周期，每月采集皮肤样本进行RNA测序，使用Bowtie、TopHat、Cufflinks、Cuffmerge、Cuffdiff、Cuffcompare、CPAT和CPC软件分析DE-mRNA和DE-lncRNA,联合PCA分析它们对次级毛囊生长周期的应答，利用WGCNA挖掘调控山羊绒生长的基因模块，GSEA分析候选基因集的生物学功能。结果表明：1)筛选得到组间DE-mRNA 2 024个和DE-lncRNA 329个，它们应答了绒山羊皮肤次级毛囊的生长周期。2)获得有生物学意义的对照组7个和试验组9个基因模块。3)深入分析富集到平衡哺乳动物皮肤生长分化、毛囊形态发生的Hippo信号通路基因模块，揭示了外源褪黑素诱导下调控山羊绒生长候选基因集191个mRNA和49个lncRNA的共表达调控网络关系。4)发现候选基因集与皮肤发育生物学过程(|NES|>1且FDR1且FDR1且FDR1且FDR<25%)显著关联。综上，确定了调控山羊绒生长的关键通路Hippo信号通路，在组学水平从基因集角度解析了调控山羊绒生长的mRNA和lncRNA的共表达调控关系，为进一步研究外源褪黑素促山羊绒生长的机制提供参考。

脂肪甘油三酯水解酶(ATGL)是脂肪水解过程中的主要限速酶，是调控细胞中甘油三酯和脂肪酸之间平衡的关键因子。为了分析奶山羊ATGL基因启动子的结构及转录调控机制，以奶山羊全血DNA为模板，通过PCR技术扩增出ATGL基因5′侧翼序列并进行生物信息学分析；构建了5个不同长度的启动子缺失片段报告基因载体，通过转染奶山羊乳腺上皮细胞并检测其活性，确定其核心区域；分别用PPARG激动剂罗格列酮和SREBP1激动剂T0901317处理细胞，检测其对ATGL启动子活性的影响。结果表明，克隆得到奶山羊ATGL基因5′侧翼序列2 721 bp,包含转录起始位点上游2 024 bp。经在线软件分析发现，ATGL启动子含有真核生物启动子元件TATA-box和CpG岛；对转录因子结合位点预测发现，其上含有FOXO、SREBF1、PPARG、C/EBPα和E2F1等结合位点。启动子活性分析结果表明，ATGL启动子核心区域位于转录起始位点上游-256—+1位，且在-527—-256位存在负调控元件。用罗格列酮和T0901317处理细胞后发现，二者均能显著上调ATGL启动子活性，且罗格列酮作用的区域为-527—-256位，T0901317在-882—-527位发挥作用，表明PPARG和SREBP1调控ATGL启动子活性。

利用“forced”限制性酶切片段长度多态性PCR技术 ,检测湖羊、小尾寒羊和新疆细毛羊的DNA样本是否存在Booroola (FecB)基因。结果表明 ,12头湖羊均为纯合型Booroola基因携带者 ;12头小尾寒羊中 ,4头为Booroola基因纯合型 ,7头为杂合型 ,1头不携带Booroola基因 ;12头新疆细毛羊均不携带Booroola基因。

【背景】羊大肠杆菌病是一种以剧烈腹泻和败血症为特征的急性传染病,是规模化羊场最为常见高发的细菌性疾病之一,尤其是初生羔羊易被产肠毒素大肠杆菌(ETEC)感染,引起羔羊腹泻,又叫羔羊白痢,使养殖场遭受严重的经济损失。而传统的抗生素治疗方案存在诸多缺陷。【目的】本研究通过让湖羊羔羊口服大肠杆菌F17菌株获得不腹泻和腹泻的羔羊个体,筛选出服用大肠杆菌F17菌毛后不腹泻与腹泻型个体中差异表达的circRNA,进而探究circRNA在绵羊抗腹泻中的作用,从而发现与抗大肠杆菌病性状相关的候选基因。从circRNA层面上,加深对绵羊拮抗大肠杆菌F17菌株的认识,确定绵羊拮抗大肠杆菌F17菌株的功能基因。【方法】用CIRI软件从头预测circRNA,利用RNA-seq技术,首次筛选出感染大肠杆菌F17菌株后不腹泻与腹泻型羔羊个体脾脏中差异表达的(DE)circRNA,对差异表达转录本进行GO富集分析,结合GO注释结果对其功能进行描述。统计每个GO条目中所包括的差异转录本个数,并用Fisher’s exact test计算每个GO条目中差异转录本富集的显著性。然后随机选择6个DE circRNA,利用q-PCR分别验证这6个DE circRNA在不腹泻和腹泻组羔羊脾脏内的相对表达水平,进而利用Miranda软件来预测与miRNA结合的circRNA以及miRNA的靶基因,根据miRNA靶基因的功能注释来阐明此部分circRNA的功能,分析circRNA-miRNA-mRNA相互作用,最后用q-PCR验证circRNA在不腹泻组和腹泻组羔羊体内的相对表达水平。【结果】绘制参考序列后,鉴定出已知的7 730个circRNA,DE circRNA与GO数据库进行比对,发现一共有60条circRNA被注释和分类到297个功能亚类中。利用RNA-seq在不腹泻和腹泻羔羊脾脏中筛选出60个差异表达的(DE) circRNA,其中31个上调和29个下调,用q-PCR验证随机选择的6个DE circRNA在不腹泻组和腹泻组羔羊体内的相对表达水平,发现与RNA-seq结果一致。利用Miranda分析circRNA-miRNA-mRNA相互作用,发现6个circRNA、5个miRNA和8个mRNA之间存在一定的靶标关系,用q-PCR验证mRNA在不腹泻组和腹泻组羔羊体内的相对表达水平,发现与RNA-seq结果一致。【结论】探究了对于不腹泻和腹泻羔羊脾脏中circRNA的表达谱,进一步了解其在绵羊抗病发生过程中的调控作用。发现了不腹泻和腹泻羔羊脾脏中差异表达的circRNA,有助于找出羔羊如何抵抗腹泻的发生机制,为羔羊抵抗腹泻提供科学的依据。

随机抽取湖羊 6 3只、同羊 6 5只分别进行 14个结构基因座和 7个微卫星标记的遗传检测 ,比较由两种遗传标记获得的群体基因平均杂合度 (H)、多态信息含量 (PIC)及群体有效等位基因数 (Ne)。结果表明 :由微卫星等位基因频率获得的群体基因平均杂合度、多态信息含量及有效等位基因数显著大于由结构基因座获得的 ,且在两群体中变化趋势一致。提示 :结构基因座和微卫星标记是绵羊群体遗传多样性研究的可靠遗传标记 ,而微卫星标记揭示更为丰富的遗传变异 ;两绵羊群体在结构基因座和微卫星DNA两个层次上具相当的遗传多样性 ;微卫星标记可有效用于近缘群体间的遗传分析。