[目的]本文旨在探究长链非编码RNA（long no-coding RNA，lncRNA）MSTRG.96141.1转录本表达特征及参与湖羊卵巢颗粒细胞凋亡（granulosa cell，GC）的调控机制。[方法]挖掘课题组前期高低繁湖羊(高繁，High prolificacy Fec^BB，HPBB；低繁，Low Prolificacy Fec^BB，LPBB)健康优势卵泡（> 5 mm）全转录组测序数据，鉴定到差异miR-3957-3p，采用生物信息学、双荧光素酶报告等方法确定与miR-3957-3p存在靶向关系的lncRNA；在此基础上，以湖羊GC为模型，采用过表达/干扰、qRT-PCR、FSIH、细胞流式术等技术，分析其表达特征和对湖羊GC凋亡的影响。[结果]miR-3957-3p表达水平HPBB组显著低于LPBB组；lncRNA（MSTRG.96141.1）与miR-3957-3p存在靶向关系；该转录本在湖羊生殖器官中的卵巢上表达最高，HPBB组显著高于LPBB组；进一步在湖羊卵巢GC中检测到该转录本的阳性信号，且定位于GC细胞质；干扰MSTRG.96141.1上调BAX基因mRNA表达水平和BAX:Bcl-2比率，进而促进湖羊GC凋亡；过表达miR-3957-3p上调BAX基因mRNA表达水平和BAX:Bcl-2比率，下调Bcl-2基因mRNA表达水平，进而促进湖羊GC凋亡；干扰miR-3957-3p则与之相反。[结论]MSTRG.96141.1通过吸附miR-3957-3p参与调控湖羊GC凋亡，进而影响卵泡发育。而MSTRG.96141.1能否作为湖羊繁殖力的分子标记，还需要进一步探究。

【目的】预测母猪Kiss1(GenBank Gene ID:100145896)上游区域潜在的转录因子结合位点,并验证部分转录因子在猪卵巢颗粒细胞中对Kiss1基因的调控作用,为研究Kiss1基因在母猪卵巢颗粒细胞中的分子调控机制提供理论基础。【方法】参考NCBI数据库中Kiss1基因上游区域的序列,通过生物信息学网站预测的Kiss1基因上游区域潜在转录因子结合的位点,结合文献阅读与资料查询,在转录因子CEBPα和p53与Kiss1基因上游区域潜在结合位点附近设计引物,利用染色质免疫共沉淀(ChIP)技术,验证转录因子CEBPα和p53与Kiss1基因上游区域的结合情况;参照NCBI数据库相关转录因子CEBPα和p53的mRNA序列,使用软件Primer Premier5设计引物,PCR分别扩增转录因子CEBPα(带有Kpn I和Xho I限制性内切酶的酶切位点)和p53(带有Kpn I和Hind III限制性内切酶的酶切位点)的CDS区序列,并进行测序鉴定,连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,构建含有潜在转录因子CEBPα和p53 CDS区序列的真核表达载体,并获得无内毒素质粒,分别命名为pcDNA3.1-CEBPα和pcDNA3.1-p53;化学合成目标转录因子CEBPα和p53的干扰siRNA片段。屠宰场采集猪的卵巢,快速分离并培养原代猪的卵巢颗粒细胞,阳离子脂质体转染法分别将转录因子CEBPα和p53真核表达载体(pcDNA3.1-CEBPα和pcDNA3.1-p53)或siRNA片段(CEBPα-siRNA和p53-siRNA)转染进母猪卵巢颗粒细胞,使用实时荧光定量PCR和Western Blot技术分别验证预测的转录因子CEBPα和p53对Kiss1基因mRNA水平和蛋白水平的影响。【结果】生物信息学预测结果表明,Kiss1基因上游区域(-850—+221)存在p53(肿瘤抑制蛋白,tumor protein p53,p53)、CCAAT增强子结合蛋白(CCAAT/enhancer binding protein, CEBP)、信号传导及转录活化家族Stat4(signal transducer and activator of transcription 4, Stat4)等转录因子的潜在结合位点,其中转录因子p53(GenBank Gene ID:397276,NM_213824.3)可能结合在Kiss1基因上游区域-533—-523 bp处,转录因子CEBPα(GenBank Gene ID:397307,XM_003127015.4)可能结合在Kiss1基因上游区域-744—-733bp处;ChIP结果表明,转录因子p53和CEBPα可以特异性的结合在Kiss1基因上游区域-533—-523 bp和-744—-733 bp处;在母猪卵巢颗粒细胞中超表达转录因子p53或CEBPα后,Kiss1基因的mRNA的表达水平显著下降(P<0.05),蛋白水平显著下降(P<0.05);在母猪卵巢颗粒细胞中,干扰转录因子p53或CEBPα后,Kiss1基因的mRNA的表达水平显著升高(P<0.05),蛋白水平显著升高(P<0.05)。【结论】在猪卵巢颗粒细胞里,转录因子p53和CEBPα能结合到Kiss1基因的上游区域降低其启动子转录活性,进而降低其mRNA和蛋白表达水平。

[目的] 了解猪DCN基因的序列特征、蛋白结构和性质，探讨其在猪卵巢颗粒细胞凋亡过程中的作用。[方法] 利用PCR扩增和测序技术获得猪DCN基因编码区序列，并进行生物信息学分析；利用双酶切法构建猪DCN基因的过表达载体，瞬时转染至体外培养的猪卵巢颗粒细胞中，利用qRT-PCR和western blot技术检测其mRNA和蛋白水平；利用流式细胞术检测猪卵巢颗粒细胞凋亡率。[结果] 猪DCN基因编码区核苷酸序列与哺乳动物其它物种在进化过程中比较保守。猪DCN基因编码蛋白含有360个氨基酸，有糖胺聚糖附着位点（GAS）、亮氨酸重复序列N端结构域（LRRNT）和12个富亮氨酸重复序列（LRR）等重要的保守结构域。猪DCN蛋白三级结构呈马蹄铁形状。成功构建了猪DCN基因真核生物表达载体，转染体外培养的猪卵巢颗粒细胞后发现，DCN过表达显著促进了猪卵巢颗粒细胞凋亡率，显著上调了促凋亡基因BAX与凋亡标志蛋白cleaved-Caspase3的表达水平，而BCL-2/BAX比值则显著降低。[结论] DCN基因在哺乳动物的进化过程中比较保守，是猪卵巢颗粒细胞的促凋亡因子。

为构建绵羊血管内皮生长因子(VEGF)基因siRNA载体并对其在绵羊颗粒细胞中的表达,采用DMEM/F12培养液对绵羊卵巢颗粒细胞进行体外培养,采用脂质体转染法将干扰载体转染到颗粒细胞中,用ELISA试剂盒测定转染后各组颗粒细胞中VEGF的表达量。转染阳性对照载体PGC的颗粒细胞组为对照组,转染PGC-1、PGC-2和PGC-3的颗粒细胞组分别为试验组Ⅰ、试验组Ⅱ和试验组Ⅲ。与对照组相比,各试验组中VEGF的表达量分别降低了55.37%、81.45%和73.29%,其中载体PGC-2所转染的细胞中VEGF的表达量最少,说明在3个载体中,PGC-2对VEGF的基因沉默效果最好。

【目的】通过small RNA高通量测序技术,筛选绵羔羊和成年母羊差异表达miRNA,进一步挖掘和鉴定与卵泡发育相关的相关基因,揭示其性状差异的信号通路及分子调控网络。【方法】以绵羔羊和成年母羊颗粒细胞为研究对象,应用高通量测序技术进行small RNA文库构建,获得miRNA表达谱,鉴定差异表达miRNA,进而对这些差异表达miRNA及其靶基因进行功能注释、聚类分析及通路富集等。【结果】从2个样本miRNA库鉴定出238个已知miRNAs和79个新miRNAs。共获得9个差异miRNA,与成年羊相比,羔羊有4个miRNA上调,5个下调。其中,oar-miR-106a上调倍数最大(1. 85),oar-miR-10a下调最为显著(-2. 20)。对差异miRNAs进行GO富集和KEGG通路富集分析表明,新陈代谢途径富集的基因最多。利用qRT-PCR对5个随机挑选的miRNA进行验证,结果与测序数据一致,说明测序结果可靠。【结论】miRNAs可能在激素处理后对绵羊生殖生理中起着重要的作用,包括卵泡和卵母细胞的发育,颗粒细胞的增殖等。

【目的】卵巢颗粒细胞的增殖和分化是原始卵泡生长启动的关键因素，卵巢颗粒细胞过度凋亡是卵泡闭锁的主要原因，因此卵巢颗粒细胞的功能对卵泡生长发育、排卵、激素分泌等至关重要。研究通过探究连环蛋白β1(catenin beta 1, CTNNB1)对猪卵泡发育过程中颗粒细胞的增殖、凋亡及类固醇激素分泌等功能的影响，为猪卵泡发育的分子调控机制研究提供参考。【方法】利用RNA抽提、实时定量PCR(Quantitative real time PCR, qRT-PCR)等方法，构建CTNNB1在母猪卵巢、肌肉、大脑等9个组织的表达谱；检测母猪性成熟过程中卵巢组织和小（≤3 mm）、中（3—6 mm）、大（≥6 mm）卵泡颗粒细胞中CTNNB1的表达情况。构建CTNNB1的真核表达载体及合成siRNA，转染至猪卵巢颗粒细胞，采用EdU、Annexin V-FITC/PI双染、ELISA等方法，检测CTNNB1对颗粒细胞增殖、凋亡、类固醇激素分泌的影响，以及对类固醇激素合成通路重要基因转录表达的影响。【结果】与肌肉、大脑等组织相比，CTNNB1在卵巢中mRNA表达水平最高。性成熟母猪卵巢中CTNNB1转录水平显著高于性成熟前和性成熟后的母猪；卵巢卵泡中CTNNB1转录和蛋白水平随卵泡发育明显上调；且卵巢颗粒细胞中CTNNB1转录和蛋白水平也随卵泡的发育逐渐上调。更重要的是，CTNNB1显著促进颗粒细胞增殖，抑制颗粒细胞凋亡；CTNNB1能够上调CYP1A1和HSD17B7的转录水平，下调CYP11A1、ESR1、ESR2、FSHR、LHR和NR5A1等类固醇激素合成相关基因的转录水平，进而促进颗粒细胞雌激素的分泌，抑制颗粒细胞雄激素和孕激素的分泌。【结论】本研究证实CTNNB1可能通过促进颗粒细胞增殖及雌激素的合成和分泌，抑制颗粒细胞凋亡及雄激素、孕激素的合成和分泌，进而促进卵泡的生长发育。

【目的】研究体外培养牛卵巢颗粒细胞中Sprouty基因(Spry)的表达,探讨成纤维细胞生长因子1(FGF1)对Spry基因表达的影响。【方法】从屠宰场收集牛卵巢,剪下直径2~5 mm的卵泡,机械破碎卵泡后收集颗粒细胞进行体外培养,在培养的第5天用FGF1和PD98059处理培养的颗粒细胞,然后用Trizol提取细胞总RNA,利用牛特异性引物进行实时定量PCR检测,用ΔΔCt方法计算Spry基因的相对表达量。【结果】牛卵巢颗粒细胞可以表达Spry基因;Spry基因的表达与FGF1呈现剂量依赖关系,Spry2和Spry4的表达量随FGF1作用时间的延长呈现出先上升后下降的变化趋势;FGF1信号通...

[目的]本试验旨在探讨脂肪因子Chemerin在牛卵巢颗粒细胞凋亡与自噬中的作用。[方法]体外培养牛卵巢颗粒细胞并用重组Chemerin蛋白(0.2μg·mL~(-1))处理24 h,采用流式细胞术和CCK-8检测细胞凋亡,通过免疫荧光检测细胞中活性氧(ROS)含量变化,测定细胞超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)含量;RT-qPCR分析凋亡与自噬相关基因Bax、Bcl-2、Caspase-3、P62和Atg7 mRNA表达,Western blot技术检测凋亡与自噬相关蛋白表达情况。[结果]与对照组相比,Chemerin处理卵巢颗粒细胞后,细胞中ROS和MDA含量显著上升(P<0.05),SOD和GSH-px活性极显著降低(P<0.05)。[结论]Chemerin可通过调控相关基因的表达诱导牛卵巢颗粒细胞凋亡并伴随自噬的发生。

为了从单卵泡水平建立非闭锁大小卵泡颗粒细胞基因表达的消减文库,选择繁殖性能正常、空怀高繁殖力黄淮山羊2只,以氯前列烯醇处理40h后取卵巢,计数卵泡并测量卵泡直径,钝性分离采集卵泡颗粒细胞,置于液氮内保存,取样后的卵泡部分组织采用原位缺口末端标记法(TUNEL)进行闭锁鉴定。选择直径6和4mm非闭锁卵泡,提取颗粒细胞mRNA,扩增cDNA,监测抑制消减杂交及其文库构建的试验环节。结果表明:消减文库的阳性克隆测序成功率100%,从正向文库中随机挑取96个克隆进行差异表达的筛选,发现12个全新表达序列标签;应用RT-PCR对已知序列的抑制素βA亚基基因(INHBA)和谷胱甘肽S-转移酶A1基因(GS...

【目的】探索miR-34a诱导GCs凋亡的RNA激活机制，为揭示猪卵泡闭锁的分子机理、筛选调控母猪繁殖的小核酸调节物提供依据。【方法】利用生物信息学方法分析猪miR-34a特征及其与潜在靶基因lncRNA NORHA启动子的结合情况。利用核质分离技术分析猪GCs中miR-34a的亚细胞定位。qPCR检测miR-34a对猪GCs中NORHA、凋亡标志基因BCL-2和BAX表达的影响。利用荧光素酶活性分析验证miR-34a对NORHA启动子转录活性的靶向调控关系。利用染色质免疫沉淀（ChIP）检测miR-34a对猪GCs中NORHA启动子miRNA反应元件（MRE）处AGO2和组蛋白修饰因子富集情况。利用western blot和流式细胞术分析miR-34a通过NORHA对下游因子FOXO1的表达和细胞凋亡的调控作用。【结果】猪miR-34a为基因间miRNA，其序列在哺乳动物中具有高度保守性。亚细胞定位分析显示，miR-34a在猪GCs中细胞核与细胞质均有分布。生物信息学分析显示miR-34a的MRE位于NORHA启动子-194 nt至-173 nt处，且两者结合自由能为-23.9 kcal·mol~(-1)。qPCR结果表明miR-34a显著上调猪GCs中NORHA的表达。荧光素酶活性分析显示，miR-34a极显著上调NORHA启动子报告载体活性，而对MRE突变型启动子活性没有显著影响。ChIP试验显示，miR-34a可增加NORHA启动子MRE处RNA诱导转录激活（RITA）复合物核心成员AGO2和转录激活型组蛋白H3K4me3的富集，而减少转录抑制型组蛋白H3K9me3的富集。共转试验显示，敲减NORHA可显著或极显著逆转由miR-34a过表达引起的FOXO1蛋白水平和早期凋亡率的上调，以及BCL-2/BAX比值的下调。【结论】细胞核miR-34a是猪GCs中的内源性小激活RNA(saRNA)，通过靶向激活促凋亡lncRNA NORHA的转录，诱导猪GCs早期凋亡（细胞膜完整），可能参与猪卵泡闭锁的启动。

构建猪ＳＩＲＴ１基因全长编码区（ｃｏｄＩｎｇ ＲｅｇＩｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ｃｄＳ）的真核表达载体，转染猪原代卵巢颗粒细胞，探讨ＳＩＲＴ１基因过表达对猪卵巢颗粒细胞中ＡＭＰＫ基因的转录及其蛋白活性的影响。测序结果表明，猪ＳＩＲＴ１基因的ｃｄＳ区全长大小为２ ２２９ ｂＰ，与ｎｃｂＩ发布的猪ＳＩＲＴ１基因Ｍ ＲｎＡ序列（ｅｕ０３０２８３．２）一致；转染Ｐ ｅｇＦＰ–ｃ１–ＳＩＲＴ１载体的颗粒细胞中ＳＩＲＴ１的Ｍ ＲｎＡ表达水平和蛋白表达水平极显著高于空载体对照组（Ｐ

[目的]本试验旨在研究卵泡抑素（Follistatin， FST）基因对湖羊卵巢颗粒细胞（Granulosa Cells， GCs）增殖及凋亡的影响，为揭示FST基因对湖羊繁殖调控机理的影响提供理论基础。[方法]首先利用免疫组织化学方法检测FST在卵巢组织中的表达特征；然后利用EdU、qRT-PCR、WB、流式细胞等技术，分析FST基因过表达和干扰对湖羊卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响；最后通过RNA-seq分析FST基因干扰前后湖羊卵巢颗粒细胞的转录组表达差异变化。[结果]FST在湖羊卵巢颗粒细胞内高表达，干扰FST能抑制湖羊卵巢颗粒细胞增殖，降低细胞中PCNA基因的mRNA和蛋白水平，过表达FST则表现出相反的趋势；RNA-seq结果进一步显示干扰FST后颗粒细胞中细胞周期调控、卵母细胞减数分裂、孕激素分泌等相关功能及通路发生显著变化。[结论]FST可以促进湖羊GCs增殖，抑制GCs凋亡，影响卵母细胞分裂、生殖激素分泌相关基因的表达，进而参与湖羊卵泡发育进程。

【目的】BCL2L11在哺乳动物中能够促进多种细胞凋亡，同时参与繁殖性状相关组织器官的发育及疾病治疗，文章利用分子生物学方法探究miR-221-3p靶向调控BCL2L11对小尾寒羊卵泡颗粒细胞凋亡的影响，为进一步研究BCL2L11在卵泡颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁过程中的调控作用提供依据。【方法】在前期课题组卵巢组织全转录组测序分析的基础上，获得了候选基因BCL2L11及其调控元件miR-221-3p，利用半定量和组织荧光定量（RT-qPCR）分析BCL2L11在小尾寒羊不同组织中的表达情况；通过RT-qPCR定量试验在小尾寒羊卵泡期和黄体期卵巢组织中鉴定了BCL2L11及miRNA-221-3p的表达情况；构建BCL2L11 3’UTR野生型和突变型载体，在HEK293T细胞中共转染miR-221-3p mimic和BCL2L11野生型和突变型及阴性对照，采用双荧光素酶报告基因检测系统确定miR-221-3p与BCL2L11靶向性关系；在绵羊卵巢原代颗粒细胞中转染miR-221-3p mimic及阴性对照实现miR-221-3p过表达，使用RT-qPCR技术在mRNA水平上检测miR-221-3p对BCL2L11以及卵巢颗粒细胞凋亡标志基因XIAP和Fas表达水平的影响；同时利用EdU试验分析miR-221-3p过表达和阴性对照组中颗粒细胞的增殖变化。【结果】半定量和组织RT-qPCR分析均表明BCL2L11在卵巢组织中表达量高于其他组织；RT-qPCR定量结果显示miR-221-3p和BCL2L11在小尾寒羊卵泡期和黄体期卵巢组织中差异表达，miR-221-3p在卵泡期卵巢中的表达量高于黄体期，而BCL2L11在卵泡期卵巢中的表达量低于黄体期，表现出负调控的现象；双荧光素酶报告基因验证分析显示，过表达miR-221-3p mimic显著抑制了BCL2L11 3’UTR荧光素酶的活性（P<0.05）;EdU试验分析显示，过表达miR-221-3p的颗粒细胞增殖率为18.9%，极显著高于阴性对照组的10.43%(P<0.01)。【结论】BCL2L11和miR-221-3p是调控绵羊卵巢发育的重要基因及调控元件，BCL2L11是miR-221-3p的靶基因之一，miR-221-3p过表达可抑制颗粒细胞凋亡，该作用结果可能通过抑制靶基因BCL2L11的表达进而影响了绵羊卵巢颗粒细胞的凋亡。

【背景】卵泡颗粒细胞（Granulosa cells,GCs）凋亡是导致卵泡闭锁的重要原因，竞争性内源RNA(competing endogenous RNAs,ce RNA）机制已被证明参与调控GCs的凋亡过程。前期牦牛卵巢转录组测序发现lnc RNA-MSTRG.7889.1与bta-mi R-146a具有结合位点，而bta-mi R-146a和Smad4存在靶向关系。【目的】通过探究影响牦牛卵泡GCs凋亡的ce RNA分子调控机制，为揭示牦牛生殖调控的奥秘奠定基础。【方法】采集和分离成年母牦牛的健康和闭锁卵泡，利用RT-q PCR法检测lnc RNA-MSTRG.7889.1、bta-mi R-146a和Smad4在卵泡中的表达。制作牦牛健康和闭锁卵泡组织切片，TUNEL检测健康卵泡和闭锁卵泡中GCs的凋亡情况；荧光原位杂交分析lnc RNA-MSTRG.7889.1、bta-mi R-146a和Smad4在卵泡中的定位。体外分离和培养牦牛GCs，分别转染Smad4过表达载体和bta-mi R-146a mimics，流式细胞术检测GCs细胞凋亡率，Western blot检测促凋亡蛋白CASPASE3和BAX，抑凋亡蛋白BCL-2的表达；GCs共转染Smad4过表达载体和bta-mi R-146a mimics后，探究bta-mi R-146a是否靶向Smad4影响牦牛GCs的凋亡。将lnc RNA-MSTRG.7889.1过表达慢病毒载体感染GCs，流式细胞术和Western blot检测lnc RNA-MSTRG.7889.1对GCs凋亡的影响；lnc RNA-MSTRG.7889.1载体和bta-mi R-146a mimics共转染GCs，进一步分析lnc RNA-MSTRG.7889.1是否竞争性结合bta-mi R-146a靶向Smad4影响牦牛GCs的凋亡。【结果】lnc RNA-MSTRG.7889.1和Smad4 m RNA在牦牛健康卵泡中的表达极显著高于闭锁卵泡（P<0.01），而bta-mi R-146a的表达则相反（P<0.01）。TUNEL检测结果显示，在闭锁卵泡中GCs的荧光强度极显著高于健康卵泡（P<0.01），说明闭锁卵泡中GCs凋亡显著高于健康卵泡。荧光原位杂交结果显示Smad4、bta-mi R-146a和lnc RNA-MSTRG.7889.1在牦牛卵泡中共表达，其在健康和闭锁卵泡中的表达与RT-q PCR结果基本一致，提示可能存在ce RNA机制参与牦牛健康卵泡发育和卵泡闭锁过程。在牦牛GCs过表达Smad4使细胞凋亡率显著降低（P<0.01),CASPASE3和BAX蛋白的表达显著降低（P<0.01),BCL-2蛋白的表达显著升高（P<0.01）；过表达bta-mi R-146a使GCs凋亡率显著升高（P<0.01),CASPASE3和BAX蛋白的表达显著升高（P<0.01),BCL-2蛋白的表达显著降低（P<0.01);bta-mi R-146a靶向抑制Smad4的表达（P<0.01);Smad4和bta-mi R-146a共转染GCs，结果显示bta-mi R-146a靶向抑制Smad4降低前者对GCs凋亡的促进作用（P<0.01）。过表达lnc RNA-MSTRG.7889.1使牦牛GCs凋亡率显著降低（P<0.01),CASPASE3和BAX蛋白的表达显著降低（P<0.01),BCL-2蛋白的表达显著升高（P<0.01);lnc RNA-MSTRG.7889.1显著抑制bta-mi R-146a的表达（P<0.01）。将lnc RNA-MSTRG.7889.1和bta-mi R-146a共转染GCs，结果表明lnc RNA-MSTRG.7889.1靶向bta-mi R-146a降低后者对GCs凋亡的促进作用（P<0.01）；而且RT-q PCR法和Western blot检测结果表明lnc RNA-MSTRG7889.1竞争性结合bta-mi R-146a促进Smad4 m RNA和蛋白水平的表达（P<0.01）。【结论】lnc RNA-MSTRG.7889.1竞争性结合bta-mi R-146a促进Smad4的表达抑制牦牛GCs的凋亡。

［目的］本试验旨在研究抑制氧化应激诱导的自噬对猪卵巢颗粒细胞凋亡的作用。［方法］采用流式细胞术和细胞计数试剂盒（ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ－８，ｃｃｋ８）检测不同浓度（０、５０、１００和１５０μｍｏｌ·ｌ～（－１））过氧化氢处理１２ ｈ对猪颗粒细胞的凋亡诱导作用和细胞活力的影响；Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测微管相关蛋白１轻链３（ｌｃ３，包括ｌｃ３－Ⅰ和ｌｃ３－Ⅱ）和自噬相关蛋白Ｐ６２／ｓＱｓｔｍ１的表达量变化，转染ｇＦＰ－ｌｃ３质粒检测自噬体的数量；利用３－甲基腺嘌呤（３－ｍＡ）提前４ ｈ抑制自噬后再氧化应激１２ ｈ，用流式细胞术检测细胞的凋亡率，ｃｃｋ８检测细胞活力。［结果］氧化应激．．．