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[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
黎淑娟 邢晓为 薛立群 黄生强 袁洪 王维
为探明湖南沙子岭猪内源性逆转录病毒携带情况及病毒亚型分布,应用gag,pol特异性引物,对31头湖南沙子岭猪耳部组织的DNA,RNA样品进行了PCR,RT-PCR检测,依据env基因表型env-A,env-B,env-C,鉴定了每头猪携带PERV亚型.结果表明,在所检31头个体中,93.5%的个体基因组中同时有PERV的A,B 2种亚型(记为env-AB),另外6.5%的个体基因组中则同时有PERV的A,B,C 3种亚型(记为env-ABC),所有个体的耳样组织中均未检测到单独存在的PERV的A,B或C亚型.说明湖南沙子岭猪中存在PERV序列,且能以mRNA的形式表达,病毒亚型以env-AB为...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
丁芳 吕茂民 马玉媛 吴健敏 田克恭 毕丁仁 章金刚
【目的】构建以缺失不同功能区的猪内源性反转录病毒(PERV)5′非编码区(5′UTR)为启动子的萤光素酶表达载体,分析5′UTR的转录调控规律。【方法】将含有不同功能域的PERV的UTR克隆至萤光素酶表达载体上,转染瞬时表达细胞Cos-7,检测萤光素酶的表达。【结果】缺失R区的5′UTR显示出很强的启动子活性,U3重复区序列缺失的5′UTR启动子活性显著下降。UTR显示出较之LTR强的启动子活性。缺失整个U3区的UTR比仅缺失U3重复区的UTR启动子活性强。【结论】在R区有转录因子的结合位点可引起转录活性下降;U3重复区序列表现出增强子的活性。在5′UTR的下游序列中,包括引物结合区(PBS)...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
张金凤 曾令兵 张辉 周勇 肖艺 苏岚 高正勇
根据草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)衣壳蛋白VP6编码基因的序列设计特异性引物,以病毒全基因组RNA为模板,通过对反应条件进行优化,建立了GCRV的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。检测结果表明,本方法可在63℃下1 h内实现靶片段的大量扩增,扩增产物经凝胶电泳呈现梯型条带,反应体系中添加SYBR Green I荧光染料后,绿色阳性结果明显区别于橙色阴性结果。该检测体系针对草鱼呼肠孤病毒的检测灵敏度高,其最低检测限为33 pg,与常规RT-PCR方法相比较,灵敏度高10倍,且与斑点叉尾鮰呼肠孤病毒(CCRV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、锦鲤疱...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
饶桂波 钟雅婷 欧阳康 马玲 黄红梅 吴健敏
【目的】确定广西巴马小型猪内源性反转录病毒(PERV-BM)的进化年代。【方法】对先前扩增、测序获得的9个PERV-BM的LTRs,一个PERV-BM全长基因组序列,登录号为HM159246及Gen Bank上发表的所有背景清楚的猪内源性反转录病毒(PERV)的LTRs及env序列进行分析。首先利用DAMBE软件对上述序列比对分析,合并同源性较高的,筛选有差异代表性的核酸序列的数据集。然后利用MEGA5.2软件Neighbor-Joining方法计算PERV-BM遗传进化关系。利用DAMBE软件对上述筛选的序列集进行替换饱和度计算,分析核酸进化速率的稳定性;利用MEGA5.2软件,通过最大相似...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
许荣 张春林 宁静 李建 雷安民
【目的】构建小鼠pMX-H1foo逆转录病毒载体,并使其在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中异位表达,为进一步研究H1foo在重编程方面的作用奠定理论基础。【方法】根据NCBI公布的小鼠H1foo基因的mRNA序列设计引物,以小鼠卵巢组织总RNA为模板,RT-PCR扩增小鼠H1foo CDS序列,并连接到逆转录病毒载体pMX上。经双酶切鉴定和测序比对正确后,利用磷酸钙转染包装细胞plat-E的方法制备H1foo病毒液并感染MEF细胞,进一步收集感染的细胞进行半定量RT-PCR和免疫荧光染色检测,分析其在细胞中的表达情况。【结果】克隆得到915bp的H1foo基因,构建得到逆转录病毒载体pMX-H1...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
张秋婷 苗向阳 安铁洙
【目的】通过重组逆转录病毒体内感染源于第X期胚盘细胞的方法获得嵌合体鸡。【方法】将扩增的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的开放阅读框插入逆转录病毒表达载体pour-pBabe中获得重组逆转录表达载体;采用磷酸钙转染法将其与包装载体pVSVG共转入29310A1包装细胞中进行病毒包装,得到病毒原液经超速离心浓缩200倍后注入种蛋(第X期)胚盘下腔,孵化种蛋。提取孵化5.5天的鸡胚基因组DNA,进行PCR检测和Southern杂交检测。【结果】构建含EGFP完整开放阅读框的逆转录病毒表达载体pour-pBabe-EGFP,提取孵化5.5d鸡胚基因组DNA,经PCR、Southern杂交检测,嵌合...
[期刊] 淡水渔业
[作者]
张旻 王娜 景宏丽 吴绍强
为提高草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)的检测效率,根据GCRV-873株VP5基因片段,设计了2对特异性引物,建立了检测GCRV-873株的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。结果显示:该方法使用25μL反应体系,经优化后的反应温度为65℃,反应时间1 h,检测限可达10个拷贝数的病毒核酸,比传统的RT-PCR方法要高10倍。且不与鲤春病毒、传染性造血器官坏死病病毒、传染性胰脏坏死病毒和病毒性出血性败血症病毒RNA产生交叉反应。在反应体系中加入染料后,反应结果肉眼直接可见,是一种特异性强、方便快捷的检测方法,适合GCRV-873株的现场初筛和核酸检测工作。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
陈信忠 苏亚玲 龚艳清 黄丽莎 俞秀霞 苏永全
神经坏死病毒(Nervousnecrosisvirus)是导致多种海水鱼类神经性病害的致病原。发病及死亡的石斑鱼除了表现神经异常症状外,无明显的临床病症,体表及内脏组织也未发现明显病变及寄生虫感染。2003年4～8月,应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从福建南部人工养殖的5种石斑鱼即紫石斑鱼(Epinepheluslanceolatus)、马拉巴石斑鱼(E.malabaricus)、青石斑鱼(E.awoara)、赤点石斑鱼(E.akaara)和云纹石斑鱼(E.moara)中检出5个神经坏死病毒分离株。检测了76份石斑鱼样品,这些石斑鱼NNV病毒的平均感染率约为90%。对这些病毒的RT...
[期刊] 水产学报
[作者]
李军 王铁辉 周立冉 易咏兰 刘汉勤 陆仁后 陈宏溪
人工感染GCHV－861后，对处于潜伏期、发病期和恢复期等不同时期的草鱼内脏组织匀浆上清液进行逆转录聚合酶链式反应（RT－PCR）扩增，除恢复期的1条草鱼外，其余样品均得到特异扩增带，而对照组都没有，预示着RT－RCR技术对于草鱼出血病的早期诊断、防治及抗病有种具有重要意义。另外，对于显症出血病草鱼的肝、肾、脾、鳃、肌肉和肠道等组织器官进行检测，结果都为阳性，首次证实了GCHV存在于肝脏中，并对此作了进一步的讨论。
[期刊] 水产学报
[作者]
刘荭 高隆英 史秀杰 江育林
A reverse transcription polymerase chain reaction (RT PCR) was used for detection of infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus (IHHNV) from the gills and subcutaneous tissue of Penaeus vannamei (10-15cm in body size) without clinical signs. With primers 77012R and 77353F, a fragment o...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
侯义宏 林祥梅 张晓臣 朱中武 贾广乐 梅琳 吕建强 钱永华 韩雪清
为了建立简便、快速的AIV检测方法,根据禽流感病毒H5、H7、H9亚型HA基因和N1亚型NA基因的保守序列,设计了4对RT-PCR引物,对H5、H7、H9、N1 4个亚型进行了多重RT-PCR扩增,通过多重RT-PCR敏感性和特异性试验,建立了多重RT-PCR检测方法;应用所建立的多重RT-PCR方法和病毒分离的经典方法对395份(4省20多个地区)口岸检样进行了平行检测,并对其检测结果进行了比较。结果表明,H5、H7、H9、N1 4个亚型的扩增产物大小分别为380,641,493和328 bp,对NDVI、BV、ARVI、BDV、MDV、FPV扩增均为阴性,平行检测结果完全吻合,说明所建立的...
关键词：
禽流感 病毒检测 多重RT-PCR
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王云鹤 包红梅 孙佳善 李雁冰 徐晓龙 王子龙 施建忠 曾显营 王秀荣 陈化兰
【目的】2013年3月,中国国家卫生和计划生育委员会宣布在上海、安徽地区发现了人感染H7N9亚型流感病毒事件,由于这种新型重组H7N9流感病毒未曾有过感染人或者动物的报道,因此出现了一系列亟待解决的问题,引起了全世界范围的广泛关注。根据H7N9亚型禽流感病毒HA和NA核苷酸序列,设计并合成靶基因为HA和NA的2对引物,建立快速检测H7N9亚型禽流感病毒的一步法RT-PCR检测方法。【方法】根据测序结果,用DNAStar生物软件进行同源性分析比较,选出H7和N9基因中高度保守且特异的核苷酸区域,用oligo6.0软件设计针对H7和N9基因的引物。用Trizol LS提取RNA,采用一步法Acce...
关键词：
禽流感病毒 H7N9亚型 RT-PCR
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
任充华 张婷婷 杨涵江 王昕 陈知龙 张智英
【目的】构建能够表达人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的腺病毒。【方法】通过对PCI-neo-hTERT质粒的改造,依次构建出JMB293-hTERT、pAdTrack-hTERT载体,将pAdTrack-hTERT经PmeⅠ线性化后与pAdEasy-1载体共转化到BJ5183细菌中进行重组,经卡那霉素抗性筛选获得重组腺病毒载体pAdEasy-hTERT。将pAdEasy-hTERT PacⅠ酶切线性化并回收后,转染HEK293人胚肾细胞,培养7d后,收集细胞并反复冻融,收集细胞裂解液;反复扩增3次后,测定重组hTERT腺病毒的滴度。【结果】①利用酶切连接的方法得到了穿梭载体pAdTrack-...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
魏春华 徐叶 邓小莺 林志峰 毛婉 黄夏玲 戴爱玲 杨小燕 李娜 罗满林 刘建奎
[目的]分析我国东南地区2012-2018年规模化猪场猪圆环病毒2型(PCV2)的流行动态、基因组特性及病毒重组情况,为猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)的防控和疫苗开发提供理论依据。[方法]对2012-2018年采自福建、江西、广东、江苏及浙江等省规模化猪场疑似断奶仔猪多系统衰弱综合症(PMWS)猪只的649份组织样本及血清样本采用PCR方法进行检测,对PCV2进行基因分型,并选取54份阳性样品进行PCV2全基因组同源性比对、系统发育分析和重组分析,同时对ORF2基因进行遗传进化分析和衣壳(Cap)蛋白氨基酸序列比对。[结果]东南地区猪场感染PCV2较普遍,PCV2阳性率为41.9%(272/649)。猪场存在PCV2a、PCV2b、PCV2d和PCV2e 4个基因型毒株,其中以PCV2d流行为主。基于PCV2全长核苷酸序列和ORF2基因的系统进化分析表明,54株PCV2毒株均分为4个基因型;PCV2e毒株检出率较低(仅为0.46%),其基因组全长1 777 bp,与其他基因型代表毒株的全长核苷酸同源性较低(91.0%～93.0%)。重组分析表明,不同基因型毒株间存在重组现象。Cap蛋白的氨基酸序列分析表明,不同基因型具有特征性的突变位点。[结论]东南地区猪场存在4种基因型PCV2,其中PCV2d为优势基因型,不同基因型毒株间存在重组现象。新基因型PCV2e的检出率较低。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
李晶 余兴龙 李润成 罗维 向卫军 李薇 王亚 葛猛
根据GenBank登录的猪巨细胞病毒(PCMV)gB基因序列设计检测引物和全长gB基因引物,对来自湖南浏阳和江西景德镇不同养殖场的猪鼻拭子样品(51份)进行PCR检测,60.78%(31/51)的鼻拭子样品扩增出了260bp的特异性条带.再以阳性样品为模板扩增全长gB基因,并将其克隆到pMD18-T载体,核苷酸序列测定和结果分析表明,所获得PCMVgB基因序列全长2580bp,编码860个氨基酸,与国外PCMV分离株的核苷酸同源性为97.6%～98.9%,氨基酸同源性为97.0%～98.6%,且PCMV可分为2个群:一群为中国湖南株、英国株和德国株,命名为A群;另一群为日本株、瑞士株和西班牙株...
关键词：
猪巨细胞病毒 PCR gB基因 序列分析
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