为建立特异、敏感、快速的温氏附红细胞体诊断方法,根据温氏附红细胞体16S rRNA基因序列(GenBank登录号为AY946266),设计1对种特异性引物,建立了温氏附红细胞体的PCR诊断方法。特异性试验和敏感性试验结果表明,该方法能特异性地扩增温氏附红细胞体16S rRNA基因序列的特异性片段,检测温氏附红细胞体最低DNA量为0.178 fg。利用该方法对湖北省、江苏省和黑龙江省温氏附红细胞体病感染情况进行了流行病学调查,结果显示阳性感染率分别为10.3%、5.3%、45.8%,说明温氏附红细胞体在湖北省、江苏省和黑龙江省均存在,流行病学调查显示湖北省感染率较高、流行较广。

【目的】针对猪附红细胞体g1基因编码的MSG1表面粘附蛋白(rMSG1)和以此蛋白制备的多克隆抗体,建立相应的ELISA方法进行猪附红细胞体的临床检测,并进行效果评估,以获得一种猪附红细胞体感染的有效检测手段。【方法】将MSG1-pET28c_E.coli BL21菌株,在适宜的条件进行诱导表达,经菌体破碎、层析等步骤获取纯化的目的蛋白。以纯化的rMSG1制备免疫原接种小鼠,获取符合要求的多克隆抗体。以rMSG1和多克隆抗体建立ELISA检测方法,分析其敏感性、特异性、符合性和重复性。【结果】接种后获得了符合效价的抗血清;基于rMSG1的间接ELISA方法临床检测猪附红细胞体感染率为46.25...

本研究应用聚合酶链反应(PCR)建立了一种检测人及牛粪便中隐孢子虫卵囊 DNA 的方法.以蔗糖梯度离心法纯化鼠源 C.muris 卵囊;甘油漂浮-G_3耐酸漏斗过滤法纯化牛源 C.muris、牛源 C.parvum 和鼠源C.parvum 卵囊.结果发现甘油漂浮-G_3耐酸漏斗过滤法纯化隐孢子虫卵囊具有纯度高、回收率达96%、介质便宜及操作简便等优点.纯化卵囊经液氮冻融后按常规法提取 DNA 作为 PCR 模板.根据 GenBank 中C.muris 和 C.parvum 18SrRNA 基因序列,应用计算机辅助设计合成一对 PCR 引物(上游引物:5′-AAACCCAACTTTGCG...

为实现抗猪附红细胞体药物的高通量筛选,拟建立小鼠最优感染模型及应用其进行药物敏感性研究。采用三因素三水平的正交试验法,通过对感染率、菌血症峰期及临床症状考察,确定最佳感染方法、感染途径和接种剂量。而后应用感染模型对土霉素、四环素、贝尼尔、青蒿素、咪唑苯脲等10种抗生素和抗原虫药进行药物敏感性测试。方差分析结果显示,以0.1mL剂量尾静脉接种猪EH提纯液,能够使处于免疫抑制状态的昆明小鼠在3d时达到菌血症峰期。药物敏感性测试反映贝尼尔、咪唑苯脲和青蒿素对猪附红细胞体作用最强。因此,用此模型可进行体内抗猪附红细胞体药物的高通量筛选。

【目的】建立快速、准确检测鸭副粘病毒病的方法。【方法】根据GenBank中发表的新城疫F基因序列设计1对引物,扩增鸭副粘病毒融合蛋白基因727bp的特异性片段,进行特异性试验和敏感性试验,建立了鸭副粘病毒病的RT-PCR诊断方法。应用建立的诊断方法,对从山东不同地区分离的20株疑似鸭副粘病毒毒株和150份疑似感染副粘病毒鸭的病变组织进行了检测。【结果】特异性试验表明,建立的RT-PCR检测方法能够从鸭副粘病毒SDFCH株中扩增到727bp的特异性片段,而对鸭瘟病毒、H9N2亚型禽流感病毒、鸭肝炎病毒的扩增结果均为阴性;敏感性试验表明,该法最低检出量的cDNA质量浓度为3pg/μL;山东不同地区...

根据NCBI公布的温和气单胞菌(Aeromonas sobria)丝氨酸蛋白酶的基因序列,设计并选取一对能够快速而准确地检测温和气单胞菌的PCR引物,建立PCR快速检测体系,并对患病的鱼组织进行检测。研究结果表明,使用设计的引物能够扩增出与预计大小相符合的131 bp的特异性片段,具有较好的检测特异性,对靶标DNA的检测灵敏度为1.0 pg/20μL,对温和气单胞菌的检测灵敏度为50 cfu/20μL。样品的检测结果与实际发病情况一致,表明本研究成功建立了温和气单胞菌常规PCR检测体系,该体系可以用于温和气单胞菌的诊断和样品的检测。

从RAPD扩增的鳜鱼病毒 (SCV)核酸电泳带中回收了二个片断 ,克隆子pUC19质粒 (称为SCVE36 9和SCVE45 0 )。序列分析表明插入片段分别为 36 9bp和 45 0bp与GenBank序列没有显著的同源。根据克隆序列设计两对引物P1/ P2 和P3 /P4 ,在健康鳜鱼、病鳜以及提纯的SCV核酸中进行PCR试验。结果表明 ,P1/P2 组引物在SCV基因组中扩增出特异性核酸片段 ,可作为鳜鱼病毒PCR诊断 ,检测片段为 36 9bp。

为研究猪附红细胞体ＭＳＧ１蛋白质的结构与功能，应用巢氏ＰＣＲ技术克隆出１ ０１１ ｂＰ的猪附红细胞体ＭＳＧ１基因，构建系统进化树并进行生物信息学分析。系统进化树分析结果显示，猪附红细胞体与小附红细胞体之间的亲缘关系较近。生物信息学分析结果显示，ＭＳＧ１基因编码３３６个氨基酸，理论等电点（Ｐ Ｉ）为６．２１，相对分子质量为３６ ７４５．８，无信号肽和跨膜区，抗原指数较高，具有较大的免疫原性。ＭＳＧ１蛋白质的柔韧性区域较多，蛋白质３Ｄ结构显示为＂Ｘ＂立体结构，外周区域结构松散。

猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)有多个基因型,其中基因型d的感染率仅次于基因型b,建立PCV-2d基因型的PCR-RFLP诊断方法具有重要意义.根据NCBI中PCV2 Cap基因序列,设计1对特异性引物,并选择PCV-2d特异的酶切位点MSPI进行酶切,对酶切的体系和条件进行优化,同时进行敏感性、重复性试验.结果表明:PCR总体积25μL,模板量2μL,退火58℃,35个循环为PCR反应最佳条件,目的片段702 bp;MSPI酶能将PCV2d特异地切出2个条带474、228 bp.酶切体系为12.5μL、MSPI酶1μL、酶切时间1 h;该酶切体系的最低模板量为10 ng·μL-1,重复性好.送检的24份病料的PCV2d阳性率为33.3%.可见,本研究建立的PCV-2d基因型的PCR-RFLP鉴别诊断方法,特异、敏感.

【目的】对新城疫(ND)国标RT-PCR诊断方法进行改进和优化,建立一种灵敏度高、特异性好、能直接从组织病料中进行目的基因检测的NDV套式RT-PCR(nest RT-PCR,RT-nPCR)方法。【方法】根据GenBank上发表的新城疫病毒基因序列,设计并合成了2对引物,通过筛选最佳RT-nPCR条件,建立了NDV RT-nPCR检测方法。通过灵敏性试验、特异性试验、病料检测对比试验等,验证了RT-nPCR方法的可靠性和适用性。【结果】建立的NDV RT-nPCR方法灵敏度较高,检测的极限为5.6×10-5 ng/L;特异性较好,仅能从NDV中扩增到目的条带。从6份疑似组织病料中能直接检测出...

犬病专家诊断系统的建立与应用吴德华徐汉坤顾劲乔（公安部南京警犬研究所，南京２１００１２ＥｘｐｅｒｔｓｙｓｔｅｍｉｎｖｅｔｅｒｉｎａｒｙｃｌｉｎｉｃａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｔｏｄｏｇｄｉｓｅａｓｅｓＷｕＤｅｈｕａ，ＸｕＨａｎｋｕｎａ...

为了解东北三省猪附红细胞体基因的流行变异情况,本试验选取相对保守的16S rRNA核苷酸序列作为分析对象,采用酚仿抽提法提取吉林株、辽宁株和黑龙江株猪附红细胞体基因组DNA,用一对特异性引物扩增目的DNA,然后分别与pMD-18T载体连接并转化BL-21菌株,经重组质粒PCR鉴定后并测序,比较其核苷酸序列。从同源性分析结果可以看出,黑龙江株、辽宁株与广东株猪附红细胞体核苷酸同源性最高,均达到100%;吉林株与美国株猪附红细胞体的核苷酸同源性最高,为97%。系统进化分析结果显示,黑龙江株与辽宁株猪附红细胞体亲缘关系最近,而与吉林株猪附红细胞体较远。结果表明,吉林株、辽宁株和黑龙江株猪附红细胞体1...

【目的】利用RT-PCR技术建立一种在临床上便于区分猪流行性腹泻病毒(PEDV)自然感染与疫苗免疫毒株的方法。【方法】根据GenBank公布的PEDV ORF3基因序列,在其存在基因缺失区两端的保守区域设计特异性引物,对近两年采集的仔猪腹泻样品进行检测,分析流行毒株的ORF3基因,选择部分阳性样品利用鉴定引物进行RT-PCR扩增,优化其反应体系、Tm值等条件,进行鉴别诊断方法的特异性、敏感性试验,并对大量临床样品进行检测验证。【结果】从新发仔猪腹泻临床样品中克隆获得了11株PEDV的ORF3基因,序列分析显示新分离的9株ORF3基因不存在缺失,属于自然感染野毒,其与疫苗株的核苷酸同源性为95....

【目的】非洲猪瘟(African swine fever,ASF)自2018年首次暴发于我国沈阳后,迅速扩散至全国,对我国养猪业造成了沉重打击。研究针对其病原非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)建立一种快速核酸检测技术,为及时发现、准确处理ASF疫情提供一种快速诊断方法。【方法】针对ASFV保守的B646L(p72)基因,设计并筛选合适的引物、探针组合,利用基于重组酶-聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)的实时荧光RPA方法,对反应体系、反应条件、样品处理步骤等进行优化;利用质控品,对检测方法的特异性和灵敏度进行评价。对1 009份临床样品进行检测,并利用OIE推荐的实时荧光定量PCR方法(qPCR)和病毒分离,进一步验证该方法的检测结果。【结果】筛选得到一套合适的引物、探针,建立了针对ASFV p72基因的实时荧光RPA检测方法,优化后的反应体系总体积为25μL,在实时荧光定量PCR仪器上,最适反应条件为39℃10 s,39℃20 s,40个循环,扩增反应时间约20 min;室温裂解法可取代传统核酸提取方法作为本检测的样品处理方法;使用优化后的条件,可在30 min内实现样品处理、核酸扩增和结果判定的整个过程,特异性评价结果显示本方法对猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)、圆环病毒1型/2型(PCV1/2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)样品扩增结果均为阴性;敏感性评价结果显示本方法对基因I型、II型、IX型ASFV的模拟样品均可检出,对II型ASFV阳性模拟血样品可检测至10拷贝/μL,对已知阳性临床组织样品可检至1:103.0稀释度,与OIE推荐的实时荧光定量PCR(qPCR)方法的检测灵敏度一致。通过对1 009份临床样品进行检测,实时荧光RPA诊断方法检出17份阳性,其结果与qPCR方法完全一致;病毒分离获得17份阳性培养物。【结论】建立的实时荧光RPA核酸检测方法操作简便,耗时短,具有较高的灵敏度和特异性,为临床提供了一种新型、简单、特异、快速诊断非洲猪瘟的方法。

用引起猪传染性萎缩性鼻炎的支气管败血波氏杆菌全菌抗原致敏经戊二醛处理的绵羊红细胞,制备成间接血凝试验抗原,通过IHA来检测由支气管败血杆菌引起的猪传染性萎缩性鼻炎血清抗体。致敏绵羊红细胞的最佳抗原浓度为100μg/mL,血清效价≥1∶8即为阳性,效价≤1∶4者判为阴性,该方法具有很好的敏感性、特异性和可重复性,而且操作简单,适合大范围推广应用。