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[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
赵楠 闫思远 裴瑞瑞 顾沛雯
【目的】建立深色有隔内生真菌(dark septate endophyte,DSE)的遗传转化体系,获得绿色荧光蛋白(GFP)标记的DSE转化子,为研究DSE在植物根系的侵染定殖行为和侵染定殖规律奠定基础。【方法】以前期从健康枸杞根系分离的1株DSE菌株枝状枝孢菌(Cladosporium cladosporioides)S12菌株为供试材料,确定潮霉素B对其的最低抑制质量浓度,然后研究菌龄(13,15,17,19和21 h)、酶解时间(1.0,1.5,2.0,2.5,3.0和3.5 h)、崩溃酶质量浓度(10,15,20,25,30和35 mg/mL)和渗透压稳定剂种类(NaCl、KCl、CaCl_2和MgSO_4)对S12菌株原生质体制备的影响。采用聚乙二醇(PEG)介导原生质体转化法将PDL2质粒(含hph和gfp基因)转入S12菌株,对所获转化子进行表型、GFP荧光、PCR及拮抗活性(以尖孢镰刀菌枸杞专化型Fusarium oxysporum f. sp. Lycium barbarum LR-1菌株为靶标菌)检测,筛选与野生型S12菌株无明显差异且带有GFP标记的转化子。【结果】S12菌株在YPD液体培养基中培养17 h,以0.7 mol/L NaCl为稳渗剂,用30 mg/m L的崩溃酶酶解2.5 h,原生质体制备数量最多,为4.53×10~6 mL~(-1)。通过PEG介导,将PDL2质粒(含hph和gfp基因)转入S12菌株,可得47株转化子,转化效率2.35株/μg,从中筛选出10株生长速度和产孢量与野生型S12菌株无明显差异的转化子。荧光观察、PCR和拮抗活性检测结果表明,外源基因已成功整合到S12菌株中,成功建立了S12菌株的遗传转化体系,并获得了GFP标记菌株,有6株转化子对LR-1菌株的抑菌率与野生型S12菌株无明显差异。【结论】成功建立了遗传稳定性良好的S12菌株遗传转化体系,筛选出了6株抑菌效果与野生型菌株相当的转化子。
[期刊] 中南林业科技大学学报
[作者]
邓勋 宋小双 尹大川 宋瑞清
采用菌物学、生物化学等方法,对樟子松根部深色有隔内生真菌(DSE)D011和D014的分类地位进行分子验证,并从菌株生长和营养代谢的角度研究了DSE对盐胁迫的响应。结果表明:1)菌株D011和D014的ITS序列分别与Phialocephala.fortinii(D011)和P.helvetica(D014)相似度达到95%,Gen Bank登录号分别为KF973 196和KF973192;2)在Na Cl和Na2SO4胁迫条件下,DSE菌株D011和D014的生长和营养代谢与盐浓度呈明显的相关性,不同盐浓度条件下差异显著(p
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
徐萌萌 张红 何姣 涂璇 颜霞 黄丽丽
【目的】建立生防菌淡紫灰链霉菌（ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅＳ ｌａｖｅｎｄｕｌａｒｅｃｔｕＳ）ｇｃｌａ４的遗传转化体系，为定向改造基因、提高基因表达水平及其生防分子机制研究奠定基础。【方法】以具有安普霉素（ａｐｒａｍｙｃｉｎ）抗性基因标记的整合型质粒ｐＳｅｔ１５２为出发质粒，ｅＳｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｅｔ１２５６７（ｐｕＺ８００２，ｐＳｅｔ１５２）为供体，淡紫灰链霉菌ｇｃｌａ４为受体进行接合转移试验，并对影响接合效率的培养基、热激温度、接合转移时间和筛选转化子培养基等因素进行优化。【结果】成功地将质粒ｐＳｅｔ１５２转入到了生防链霉菌ｇｃｌａ４中，明确了可用于筛选链霉菌ｇｃｌａ４转化子的抗生．．．
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
范雷 张静 杨龙 李国庆
观察了农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化灰葡萄孢(Botrytis cinerea)菌株RoseBc-3的影响因素,并对遗传转化的有效性进行评估。结果表明:农杆菌与灰葡萄孢共培养的温度和灰葡萄孢分生孢子浓度均能影响转化效率,当共培养温度为22℃、灰葡萄孢分生孢子浓度为1×105个/mL时,转化效率最高,平均每平皿(直径9cm)转化子数量超过100个;通过特异性引物介导的PCR和特异性探针杂交方法,证明所获得的转化子是农杆菌中T-DNA插入造成的,且大多数(87.5%)T-DNA插入为单拷贝插入;从灰葡萄孢T-DNA插入体库筛选获得了6类突变体,即产孢显著减少或...
[期刊] 农业现代化研究
[作者]
肖媛 李落叶 徐孟亮 崔延春 夏新界
以水稻两用不育系培矮64S成熟胚为外植体,以不同组合培养基为诱导和继代培养基,建立了适合水稻培矮64S转化的高效再生体系,并通过农杆菌EHA105介导,将大肠杆菌C1基因转入培矮64S,获得再生植株。结果表明,J0N1D3为合适的愈伤组织诱导培养基,诱导率达56.44%;通过潮霉素筛选后,获得的抗性愈伤组织分化率为73.08%,经分化,获得133株再生植株;随机挑选67株再生植株经PCR检测,其中46株检测到目的条带,阳性检出率占68.66%;对PCR阳性植株进行荧光定量实时PCR分析,结果表明C1基因能在转基因植株中表达。通过对T1代PCR分析,得到目的条带,表明C1基因能在转基因后代稳定遗...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
杨春平 陈华保 钱勇 姬志勤
从新鲜苦皮藤根韧皮部分离筛选到1株内生真菌,编号为Hd3。生测结果表明,当质量浓度为50.0mg/mL时,Hd3菌株菌丝乙酸乙酯提取物对3龄粘虫、小菜蛾的胃毒活性分别为100%和26.67%;盆栽法处理中,当质量浓度为44.0mg/mL时,Hd3菌株菌丝乙酸乙酯提取物对小麦蚜虫的杀虫活性为94.11%。选用硅胶柱层析和反相半制备高效液相色谱切割分离,从Hd3菌株菌丝体乙酸乙酯提取物中得到1个杀虫活性物质H4.5,经波谱数据分析,化合物H4.5的结构为2,3-二甲氧基-5-甲基苯酚。通过形态特征、培养特性等方面的研究,将Hd3菌株初步鉴定为曲霉属(Aspergillusspp.)环绕亚属(Sub...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
顾爱国 兰琪 宗兆锋 吴文君
从新鲜苦皮藤根茎韧皮部分离并筛选到1株内生真菌,编号为2B菌株,其发酵产物对番茄灰霉病菌、烟草赤星病菌、苹果炭疽病菌、玉米大斑病菌、番茄早疫病菌5种植物病原真菌均有抑制活性,抑制率在62.5%～87.2%。通过形态特征、培养特性等方面研究,将该菌株鉴定为层出镰刀菌(Fusariumproliferatum)。
关键词：
苦皮藤 内生真菌 抑菌活性 层出镰刀菌
[期刊] 中南林业科技大学学报
[作者]
赫俊阳 宋小双 宋瑞清 邓勋
【目的】以樟子松根部深色有隔内生真菌（Dark Septate Endophytes, DSE）的分离鉴定和抗病促生菌株的筛选为目标，验证其对于樟子松的抗病性及生长发育的影响，为进一步研究深色有隔内生真菌-樟子松互作抗病机制打下基础。【方法】采用形态学鉴定和分子生物学技术相结合的方法，对樟子松根内深色有隔内生真菌进行了分离、鉴定，然后通过对峙培养和发酵液抑菌实验筛选抑制立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）的高效生防菌株，以及将深色有隔内生真菌接种到一年生樟子松苗上测定其对樟子松的促生作用。【结果】共分离得到24株DSE菌株，主要包括Phialocephala bamuru、Phialocephala fortinii、Alternaria tamaricis、Paraphoma chrysanthemicola、Paraphoma radicina等。对峙培养条件下A024、A002对立枯丝核菌抑制效果最好，达到74.69%和71.20%，其中A024对立枯丝核菌的相对抑制效果达到22.47%，在抑制立枯丝核菌生长的同时，自身菌落生长未受到限制。发酵液抑菌实验中，抑制效果最好的菌株包括A024、A083和A002，抑制率分别为69.41%、64.11%和54.11%，可有效抑制立枯丝核菌菌丝的生长。樟子松一年生苗接种实验，菌株A003、A024对樟子松表现出较好的促生作用，同对照相比苗高、地径和生物量分别提高21.34%和15.40%、34.14%和30.67%、70.52%和35.85%。【结论】通过筛选得出的深色有隔内生真菌菌株A024对立枯丝核菌的抑制效果显著，且菌株A024和A003显著促进樟子松苗木的生长发育。本研究可为进一步研究深色有隔内生真菌-樟子松互作抗病机制提供理论依据和实践基础。
[期刊] 华北农学报
[作者]
陈双臣 刘爱荣 王凤华 王菲 周洲
Micro-Tom番茄植株矮小,生长密度高,生命周期短,转化效率高,成为功能基因组学研究的新型模式植物。对影响Micro-Tom遗传转化频率的共培养时间、AS的添加、工程菌液浓度和抑制农杆菌所用抗生素种类进行了分析,建立了Micro-Tom稳定高效的遗传转化体系。以bar基因设计引物对转化群体进行PCR检测,阳性率为72.3%,平均插入位点数为1.8个。遗传体系的建立为Micro-Tom在植物生物学研究中提供理论基础。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
彭成彬 陈美霞 魏日凤 孙云 张承康 刘伟
【目的】炭疽菌属(Colletotrichum spp.)病原菌主要引起茶树叶部炭疽病害。为了降低茶树受到炭疽菌的侵害,从而防控茶树炭疽病,作者进行了病原菌的分离鉴定和遗传体系的建立。【方法】对福建省的政和县、福州市、福安市和宁德市不同茶产区的茶树炭疽病病叶采用单孢分离法分离病原菌,对分离得到的菌株采用形态学结合分子鉴定方法(rDNA-ITS序列)进行鉴定。为深入研究其致病性机理,将含有潮霉的抗性标记基因片段和融合有绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein)GFP基因的Histone 1片段的质粒pCZ007,采用聚乙二醇PEG-CaCl_2介导法,转化茶树胶胞炭疽病原菌。【结果】从4个地区共分离得到致病炭疽菌12株,并进行观察和测定。发现引起茶树炭疽病的胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)是优势菌株,并成功建立的该茶树胶孢炭疽菌的遗传转化体系,随机挑取的4个经分子验证的转化子均能观察到定位于细胞核的绿色荧光和具有抗潮霉素的特性,随后的多次传代均能够稳定观察到绿色荧光定位信号。【结论】本研究分离并经形态学结合分子检测鉴定了福建省4个茶产区的茶树炭疽病的主要病原菌为胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides),成功建立能稳定表达目的基因的遗传转化体系,为后续深入研究茶树炭疽菌相关关键致病功能基因的分子机制提供新的线索,运用绿色荧光蛋白观察茶树胶孢炭疽菌对茶树叶片的侵染过程奠定基础。
关键词：
茶树 炭疽病 分离鉴定 遗传转化 GFP
[期刊] 西南农业学报
[作者]
王春萍 谢树章 蒋晓英 吴红 周幼昆 林清 雷开荣
本研究以籼稻科恢675成熟种子为材料进行了农杆菌介导的ThIPK2基因遗传转化。结果显示:持续高温光照培养使得愈伤诱导和继代只需10～14 d,有效缩短了愈伤获得周期,且愈伤诱导率可达95.6%。抗性愈伤率为10.6%,持续高温光照培养使得抗性愈伤继代5～7 d就可大量繁殖,且抗性愈伤分化率达48.8%。经第一次继代后的愈伤转化效率显著高于未经继代的愈伤的转化效率。因此,此转化系统有效缩短了水稻转化周期,优化了籼稻遗传转化,同时为抗逆基因转入籼稻提供了参考。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张国裕 王岩 程智慧 王晓武
以建立的菜心高频再生体系为基础,利用GU S染色组织分析法研究了根癌农杆菌菌株、乙酰丁香酮(A S)、预培养时间、浸染时间和共培养时间等因素对菜心((B rassica camp estris L.var.p arach inesis)子叶遗传转化的影响,探讨了适宜菜心转化的卡那霉素与抑菌抗生素使用浓度。结果表明,农杆菌菌株AGL 0对菜心的浸染能力最强,添加100μm o l/L的乙酰丁香酮有利于菜心转化;子叶外植体预培养2 d后浸染(菌液浓度OD600值为0.8)15m in,共培养2 d,然后转移到含15 m g/L卡那霉素和100 m g/L T icarc illin的筛选培养基上,...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
张自由 连青龙 辛海波 钟雄辉 罗弦 义鸣放
在唐菖蒲‘Advanced Red’胚性愈伤组织受体系统的基础上,建立其遗传转化体系。采用根癌农杆菌(GV3101)介导法,研究了侵染液浓度、侵染时间、乙酰丁香酮(AS)浓度、负压和筛选方式等因子对唐菖蒲遗传转化效率的影响。结果表明:在遗传转化过程中,不经预培养,负压处理下,农杆菌菌液OD600为0.6～0.8,侵染时间15～20min,添加100μmol/L AS,共培养3d,可获得较高的遗传转化效率。经过3～4个月选择培养,部分抗性植株经PCR和Southern杂交检测表明,目的基因gus已整合到唐菖蒲基因组中。
关键词：
唐菖蒲 gus 根癌农杆菌 遗传转化
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
李会玲 杨春平 武金占 邵彦坡 姬志勤
为寻找天然植物源新的具有农药活性的先导化合物,从冬青卫矛根皮中分离到1株内生真菌,编号为2QR1,初步鉴定其为半知菌亚门,曲霉属(Aspergillus)。室内活性测定结果表明,2QR1菌株发酵液的杀菌活性远高于菌丝体的杀菌活性。该菌株发酵液乙酸乙酯萃取物对小麦根腐病菌、小麦赤霉病菌、苹果炭疽病菌、玉米大斑病菌、番茄叶霉病菌、烟草赤星病菌和马铃薯干腐病菌菌丝生长抑制的有效中质量浓度EC50值分别为53.6,63.1,63.3,98.2,106.5,115.9和166.3μg/mL;对玉米大斑病菌、小麦根腐病菌、烟草赤星病菌和马铃薯干腐病菌抑制孢子萌发的有效中质量浓度EC50值分别为94.8,1...
关键词：
冬青卫矛 内生真菌 代谢产物 杀菌活性
[期刊] 林业科学
[作者]
岑云昕 刘佳 陈发菊 杨敬元 刘强 王韬 梁宏伟
【目的】以楸树胚性愈伤组织为受体,建立有效的楸树遗传转化体系,为今后楸树性状的遗传改良奠定基础。【方法】通过农杆菌EHA105介导以胚性愈伤组织作为外植体进行遗传转化,通过正交试验获得最优的遗传转化条件,进而将外源基因转入到楸树基因组中。【结果】在1/2 MS培养基中添加不同梯度浓度的卡那霉素(Kana)进行选择压力筛选,在添加了60 mg·L~(-1)Kana的1/2 MS培养基中,楸树胚性愈伤组织的分化率为0.00%,存活率仅为5.71%,因此确定60 mg·L~(-1)为遗传转化的选择压。采用正交设计L18(37)进行农杆菌介导的楸树遗传转化试验,通过GUS化学组织染色统计瞬时表达率,正交试验直观分析和单因素方差分析结果表明:在预培养时间为2天,采用农杆菌菌株EHA105、菌液浓度OD600值为0.7、添加乙酰丁香酮(AS)浓度为300μmol·L~(-1)、侵染时间为10 min,共培养时间为5天的条件下,农杆菌介导的转化效率最高,且对转化效率影响最大的2个因素是乙酰丁香酮浓度和预培养时间。对浸染后的胚性愈伤组织进行8个月的筛选培养,共获得32个抗性组织团,对其中15个增殖较多的抗性愈伤组织进行PCR检测,表明86.67%的抗性组织团中有外源基因整合到楸树基因组中。内源激素水平会对植物体细胞胚分化产生影响,细胞分裂素(CTK)和脱落酸(ABA)促进体胚发生,生长素(IAA)和赤霉素(GA)对体胚发生有抑制作用。通过测定内源激素可知,转基因的抗性组织中内源CTK和ABA水平显著低于野生型的楸树胚性愈伤组织,而内源IAA和GA则显著高于野生型胚性愈伤组织,推测内源激素水平可能是转基因抗性组织体胚分化能力比较差的原因。【结论】建立了农杆菌介导的楸树胚性愈伤组织的遗传转化体系,对筛选获得的15个抗性愈伤组织进行PCR检测,其中13个抗性愈伤组织中有外源基因的整合。内源激素水平的变化可能是导致楸树转基因抗性愈伤组织难以分化的原因。
关键词：
农杆菌介导 楸树 遗传转化 内源激素
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