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[期刊] 水产学报
[作者]
余贞 毕燕会 周志刚
根据海带雄配子体抑制消减cDNA文库2个长为376 bp的表达序列标签(expressedsequence tag,EST),Blastn搜索发现它们与掌状海带的碳酸酐酶(carbonic anhydrase,CA)基因序列(GenBank登录号:AJ130777)有70%的相似性,结合该EST以及掌状海带CA基因保守序列设计引物,扩增得到海带配子体CA基因部分开放阅读框(open reading frame,ORF)序列,再以此为基础设计基因特异性引物,然后利用cDNA末端快速扩增技术(rapidamplification of cDNA ends,RACE),克隆得到一条长2 804 bp...
[期刊] 水产学报
[作者]
许玲 毕燕会 周志刚
本研究采用cDNA末端快速扩增(RACE)等技术获得海带配子体细胞一个γ-亚型碳酸酐酶(CA)基因的cDNA及DNA全长序列。其cDNA长为1 618 bp,编码由305个氨基酸组成的蛋白;DNA长为11 812 bp,具6个内含子,将开放阅读框(ORF)分割成7个外显子;其具有一个gamma-CA的结构域,并具有一个独特的左手平行β-螺旋结构域;由36个CA的氨基酸序列所构建的聚类图显示,该CA与其他物种的γ-CA聚为一支。因而,将该克隆的基因命名为Sjγ-CA。为了解其编码蛋白的功能,将Sjγ-CA的ORF亚克隆至表达载体pET28a上,导入大肠杆菌表达菌株BL21中,培养并诱导目的基因表达,亲和层析以纯化重组蛋白。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE电泳)、免疫印迹和质谱技术鉴定结果表明,纯化所获得的重组蛋白是Sjγ-CA。利用电极法和分光光度计法分别检测重组的Sjγ-CA在CO2与示,重组Sjγ-CA的水合酶比活力为0.82 U/mg,但没有酯酶活性,从而从功能上鉴定了Sjγ-CA。该研究为后续探讨Sjγ-CA在海带配子体乃至孢子体细胞或组织中的亚细胞定位等研究奠定了基础。
关键词：
海带 碳酸酐酶 亚型 基因克隆 功能鉴定
[期刊] 水产学报
[作者]
梅守华 毕燕会 周志刚
从缺刻缘绿藻的转录组数据库中搜索到5条编码该藻碳酸酐酶(carbonic anhydrase,CA)的contig序列,据此序列设计基因特异性引物,利用c DNA末端快速扩增(rapid amplification of c DNA ends,RACE)技术,克隆得到c DNA全长序列,分别命名为M iαCA1、M iαCA2、M iβCA1、M iβCA2和M iγCA,开放阅读框(ORF)长分别为963、1 089、1 041、738和687 bp,相应编码由320、362、346、245和228个氨基酸组成的蛋白。这些蛋白均富含疏水性氨基酸,分别占氨基酸总量的41.25%、45.31%、...
[期刊] 华北农学报
[作者]
毕燕会 邹丹燕 周志刚
通过基因克隆和序列测定,获得了海带(Laminaria japonica)配子体的18S rRNA基因序列,其长度为1 716bp,GenBank登录号为EU293553。以蓝藻为外类群,采用邻接法(NJ)对分属9个门的藻类的18S rRNA基因序列进行系统发育分析。结果显示,褐藻门的海带与蓝藻门的念珠藻Nostoc sp.PCC7120、红藻门的日本凋毛藻(Griffithsia japoni-ca)、绿藻门的莱哈衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)遗传距离依次为0.819,0.303和0.219;杂色藻类中,海带与隐藻门的蓝隐藻(Rhodomonas sp.CS24)...
[期刊] 水产学报
[作者]
史西志 毕燕会 周志刚
利用抑制消减杂交法(suppression subtractive hybridization,SSH)获得了海带雌、雄配子体差异表达的cDNA片段,将雄配子体差异表达的cDNA片段克隆于pGEM-T载体并转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109,构建雄配子体差异表达的cDNA消减文库。自750个阳性克隆中随机挑选100个进行PCR扩增鉴定,电泳图谱表明插入片段大小在200~1000bp之间。进一步经过Southern斑点杂交筛选后,选取10个阳性克隆进行测序和序列分析,有7个片段与GenBank数据库中已知基因序列无明显同源性,初步判断为新的基因序列,3个片段与已知Fcp基...
[期刊] 华北农学报
[作者]
毕燕会 周志刚
根据糖海带(Laminaria saccharina)光捕获蛋白基因lhcf4的cDNA全长序列(GenBank登录号:AF226860)设计引物,通过RT-PCR方法获得海带(Saccharina japonica)配子体lhcf4基因的cDNA全长序列,共1 042 bp,编码一个含218个氨基酸的前体蛋白LHCF4,推测分子量为23.11 kDa,等电点为5.36。与其同源基因相似度分析表明,lhcf基因的开放阅读框(Open reading frame,ORF)在家族内及物种间高度保守,变异主要发生在非翻译区(Untranslated re-gion,UTR)。预测LHCF4成熟蛋白三...
[期刊] 水产学报
[作者]
陈晶 王丽丽 石微微 周志刚
从已构建好的海带雄配子体抑制消减cDNA文库中,通过Southern点杂交及序列分析,发现一未知功能的差异表达基因片段(克隆b9)。首先根据该克隆序列设计基因特异性引物,利用cDNA末端快速扩增技术,自雄配子体中克隆了一条长831bp的cDNA序列,其中开放阅读框450bp,5'-非翻译区182bp,3'-非翻译区199bp且具有明显的poly(A)尾巴。同样利用PCR方法自雌配子体中克隆了该基因的cDNA序列,它与雄配子体的完全一致。蛋白同源搜索结果显示,该基因编码蛋白与点形念珠藻含有SpoIID/LytB结构域蛋白(SpoIID/Lyt Bdomain-containing protein...
[期刊] 华北农学报
[作者]
宁璞 毕燕会 周志刚
根据海带配子体光捕获蛋白基因lhcf6的cDNA全长序列(GenBank登录号:DQ250739)设计引物,利用基因组步移技术克隆得到其在雌、雄配子体中的5'-侧翼序列,长度分别为932,901 bp。测序结果比对显示二者相似度为33.3%,说明该基因在雌、雄配子体中具有不同的上游调控区。网络服务器PlantCARE和Softberry启动子元件预测结果表明,二者均含有TATA框、节律性相关元件MBS、光反应相关元件MNF1和GAG-motif,其中雌配子体lhcf6基因5'-侧翼序列还特有LHC基因特征元件AT-rich序列,雄配子体特有节律性相关元件Circadian元件,这些元件可能与该...
关键词：
海带 配子体 lhcf6 启动子 GFP
[期刊] 中国水产科学
[作者]
王潇 刘福利 梁洲瑞 袁艳敏 张朋艳 汪文俊 孙修涛
利用海带‘黄官1号’雌、雄配子体克隆系为材料，以有、无额外氮(N)、磷(P)营养盐的天然海水和人工海水为培养液，添加不同浓度的铁离子(Fe~(3+))，通过观察配子体营养生长和生殖生长状况、测定光系统Ⅱ的最大荧光产量(F_(v)/F_(m))、计算发育率(包括卵囊形成率、排卵率、幼苗形成率)，探究Fe~(3+)在不同氮磷条件下对海带配子体生长发育的影响。结果显示：在额外添加氮磷营养盐条件下，浓度为3.60 μmol/L的Fe~(3+)对海带配子体营养生长阶段的促进作用最大；Fe~(3+)浓度为3.60～17.80 μmol/L时能够提高海带配子体的最大荧光产量，促进光合作用；加Fe~(3+)能够促进海带配子体由营养生长转向生殖生长；在氮磷营养盐满足的条件下，Fe~(3+)浓度为3.60 μmol/L、8.90 μmol/L、17.80 μmol/L时可促进海带配子体的生殖生长且它们之间没有显著性差异(P>0.05)；Fe~(3+)和氮磷营养盐对海带配子体的营养生长和生殖生长具有协同促进作用，即使氮、磷营养盐充足，在无铁条件下所有的海带配子体维持在营养生长状态；即使铁营养充足，在低氮、磷浓度条件下，大部分海带配子体(65%)维持在营养生长状态，虽然小部分海带配子体 (35%) 进入了生殖生长状态，但生殖生长明显滞后于较高氮磷浓度组。本研究表明，铁和氮磷营养盐对海带配子体的营养生长和生殖生长具有协同促进作用，铁是海带配子体由营养生长到发育成熟再到有性生殖过程中的关键因素；在添加适宜浓度的氮(0.275 mmol/L)、磷营养盐(0.0112 mmol/L) 条件下，添加Fe~(3+ )3.60 μmol/L对海带配子体的生长发育促进作用最大。该结果可为提高海带育苗效率提供支撑。
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
曲赞霜 钱婷婷 侯聪 张力杰 魏志刚
本文克隆了小黑杨CA家族的6个基因成员,分别命名为Psn CA1、Psn CA2、Psn CA3、Psn CA4、Psn CA5和Psn CA6,其中Psn CA4和Psn CA6属于α碳酸酐酶家族,Psn CA1、Psn CA3和Psn CA5属于β碳酸酐酶家族,而Psn CA2属于Lbeat H超基因家族。系统进化分析表明,亲缘关系较近的是Psn CA2、Psn CA4和Psn CA6,而Psn CA1、Psn CA3和Psn CA5聚为一大类。通过实时荧光RT-PCR技术研究了小黑杨根、茎、叶中Psn CA基因的表达模式,结果表明:除Psn CA6外,其余5个基因在叶部的表达量显著高于根...
关键词：
小黑杨 碳酸酐酶基因家族 表达特性
[期刊] 水产学报
[作者]
石微微 王丽丽 陈晶 欧阳珑玲 周志刚
根据海带雄配子体抑制消减cDNA文库中筛选出的克隆18序列设计基因特异性引物,利用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE),克隆了一条长2087bp的cDNA序列(GenBank登陆号:EF490312),其中开放阅读框1275bp,5′-非翻译区(untranslated region,UTR)长118bp,3′-UTR长694bp且具有明显的polyA尾巴。蛋白同源搜索显示,它编码的蛋白与Guillardiatheta这种隐藻核型体编码的CbbX蛋白(GenBank登录号:CAB65663)具有66%同源性。推测的海带配子体cb...
[期刊] 水产学报
[作者]
刘鹏飞 谷俊刚 毕燕会 周志刚
UV性别决定系统在一些低等生物生活史的单倍体阶段展现出特定的进化和遗传特性。本研究构建了一个海带雌配子体基因组的细菌人工染色体（BAC）文库。该文库包含31 872个克隆，插入片段平均长为115 kb，覆盖6.57倍的海带基因组。利用海带雌配子体特异性的标记FRML-1488的序列为探针筛选BAC文库，获得4个阳性BAC克隆。随机挑选一个克隆（638-C12）通过Roche454第二代测序平台进行测序，并经过间隔序列的扩增、克隆和测序，了解到该BAC克隆的插入片段长为86 996 bp。该序列位于海带基因组的Scaffold285上，占后者序列总长的22.4%。序列分析结果显示在雌配子体特异性标记FRML-1488的上游存在大量的微卫星以及Copia逆转录转座子等重复序列。综合这些信息，推测BAC克隆638-C12的插入片段可能与海带U染色体的性别决定区相关。本研究是BAC文库在海带性别相关序列图位克隆的首次应用报道，将有助于海带性别染色体结构的揭示及性别决定机制的解析。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
乔醒 唐红玲 张凯岳 李鑫 曾汉来 何莹
为探讨水稻碳酸酐酶(carbonic anhydrase,CA,EC 4.2.1.1)对光合作用的影响,选取不同光合特性的4个水稻品种,测定灌浆期不同时段(开花后5、15和25d)剑叶OsCA基因的相对表达量、CA的活性和叶片净光合速率,分析CA活性及相关基因转录与光合作用之间的关系。结果表明:水稻剑叶的OsCA基因表达量、CA活性与叶片净光合速率显著相关,其相关程度在不同类型品种间存在差异,高光合特性品种R49在测定期各指标均处于最高水平。各品种的CA活性随着灌浆进程的推进呈现先升后降的动态趋势,并于灌浆中期(开花后15d)达到最大值;剑叶净光合速率在灌浆期呈现逐渐下降的趋势,而下降幅度存在...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
魏威 何玉英 李朝霞 周雨欣 李健 谢拥军
采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得中国对虾(Fenneropenaeus chinensis) ATG5基因cDNA全长，命名为FcATG5。利用实时荧光定量技术分析了FcATG5的组织表达及其在pH和碳酸盐碱度胁迫下的表达特征，并利用RNAi技术验证其功能。基因分析显示，FcATG5 cDNA全长为2225 bp，开放阅读框为810 bp，编码269个氨基酸，预测其编码的蛋白质分子量为31.10kDa，理论等电点为5.59，为疏水性蛋白，包含一个APG5自噬相关蛋白结构域，无跨膜结构，不包含信号肽。同源性和系统进化分析显示，FcATG5具有高度保守性，与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)同源性最高，达98.14%。组织表达分析显示，FcATG5在中国对虾各组织中均有表达，其中，肌肉中表达量最高(P<0.05)，血淋巴细胞中最低(P<0.05)，表明该基因的表达量越高，越有利于中国对虾存活。结果表明，FcATG5在pH、碳酸盐胁迫下的表达量均显著升高(P<0.05)，推测自噬可能参与中国对虾应对非生物胁迫的调控。本研究结果对水生动物特别是甲壳动物中细胞自噬研究具有重要的借鉴意义，有助于推进中国对虾盐碱水养殖的研究进程。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
张积森 郭春芳 王冰梅 张木清 陈由强 陈如凯
【目的】筛选并克隆与水分胁迫相关的基因,通过对目的基因的表达分析进一步解析植物的抗旱机制,为甘蔗抗逆育种提供候选基因和理论依据。【方法】应用消减文库技术结合cDNA芯片技术筛选水分胁迫诱导的基因的EST序列,根据筛选到感兴趣的上调表达基因的EST序列,用RACE技术获得SSADH的全长cDNA序列,并通过实时荧光RT-PCR技术对该基因的表达特征进行分析。【结果】通过消减文库技术结合cDNA芯片技术筛选的EST中含有4个推测为基因SSADH的EST,其在水分胁迫处理的斑茅中均明显上调表达。通过RACE扩增获得甘蔗SSADH全长cDNA序列为1914bp,其中5′端非编码区25bp,开放阅读框为...
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