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[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
王真 欧齐星 王双山 吕艳丽 吴清民
为筛选具有诊断标记的布鲁氏菌病疫苗菌株,本研究利用同源重组和负筛选技术,构建了流产布鲁氏菌株2 308的ATP/GTP结合蛋白基因缺失株BDA14,并通过菌落染色和凝集特性,培养传代,小鼠接种试验及怀孕羊攻毒试验对其生物学特性、安全性和免疫效果进行了研究。结果表明:1)缺失菌株BDA14为粗糙型菌株,体外培养传代表型不发生改变;2)缺失菌株BDA14在小鼠体内的毒力与亲本菌株2308相比显著降低,且不产生针对OPS(O-antigen)的抗体;3)缺失菌株BDA14可提供与疫苗株RB51相当的攻毒保护力;4)缺失菌株BDA14对怀孕靶动物的安全性显著提高,接种怀孕羊不引起流产。说明ATP/GT...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
丁家波 程君生 牟巍 毛开荣 张尔利 蒋玉文
【目的】WboA基因编码光滑型布鲁氏菌脂多糖(LPS)O-侧链合成必须的糖基转移酶,该基因的缺失或破坏会影响布鲁氏菌光滑型表型的形成。本研究拟构建WboA基因缺失的重组粗糙型布鲁氏菌,以使布鲁氏菌弱毒疫苗与野毒株布鲁氏菌感染相区分。【方法】以猪源光滑型布鲁氏菌S2株为研究对象,通过同源重组将氯霉素抗性基因(Cmr)完全替代S2株的WboA基因,获得重组粗糙型布鲁氏菌rS2-WboA株。【结果】rS2-WboA株在适宜的培养基(TSA)上传50代后仍保持对氯霉素的抗性。用1×107 CFU rS2-WboA免疫Balb/c小鼠和豚鼠,1个月后均能通过平板凝集试验检测到粗糙型抗体。1×1011 C...
关键词：
布鲁氏菌 WboA基因 免疫性
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
董浩 董礼华 彭小薇 王宁 曲萍 孙雨 赵柏林 胡冬梅 石慧 王晓英 宋晓晖 吴清民
为探讨牛种布鲁氏菌sigma因子RpoE2的功能,采用酵母双杂交技术对RpoE2蛋白与anti-sigma因子之间的互作进行研究;通过环境应激试验评价了rpoE2缺失株对强氧化环境、酸性pH、杀菌性阳离子多肽、铁缺乏环境的耐受能力;通过比较亲本菌株和缺失株在巨噬细胞感染模型和小鼠感染模型中的生存能力,研究了rpoE2基因是否与牛种布鲁氏菌毒力相关。结果显示:牛种布鲁氏菌的RpoE2蛋白可以与anti-sigma因子相互作用,牛种布鲁氏菌rpoE2基因缺失后,对各种应激环境的耐受能力均无影响,并且巨噬细胞和
[期刊] 中国农业科学
[作者]
陈瑞花 张辉 唐利燕 孟茹 张豫 王震 李志强 张俊波 陈创夫
【目的】布鲁氏菌外膜蛋白BP26是布鲁氏菌的重要毒力因子,本研究采用bp26基因缺失株和BP26蛋白分别与胚胎滋养层细胞(HPT-8)作用,探讨布鲁氏菌bp26基因的生物学功能。【方法】采用Ni柱亲和层析法纯化BP26蛋白,overlap技术构建布鲁氏菌bp26基因缺失株,用BP26蛋白和bp26基因缺失株分别侵染HPT-8细胞,观察细胞形态变化,ELISA检测上清中的细胞因子。【结果】从布鲁氏菌疫苗株M5-90克隆出bp26基因并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中成功表达,获得纯化的BP26蛋白,经SDS-PAGE验证正确,Western-Blot鉴定具有免疫原性。将目的片段bp2...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
李向阳 王学理 刘凯 霍晓伟 武迎红 张显华 张嘉保
为了探讨牛布鲁氏菌544A株感染巨噬细胞的c DNA文库中筛选与Omp22相互作用的蛋白,对布鲁氏菌的致病机理进行研究。将布鲁氏菌细胞膜可分为3组:第1组为94 k Da的外膜蛋白,第2组为41~43 k Da外膜蛋白,第3组为22~31 k Da的外膜蛋白。第1组外膜蛋白只是外膜蛋白的一小部分;第2组外膜蛋白是布鲁氏菌细胞外膜孔道蛋白;第3组外膜蛋白是由两种相关的22 k Da蛋白和31 k Da蛋白组成,31 k Da蛋白已经被证实了是一类细胞外膜孔道蛋白,而22 k Da蛋白(Omp22)的功能还不是很清楚。酵母双杂交技术是一种常用的而且有效地研究蛋白-蛋白相互作用的方法,已经广泛的应用...
关键词：
Omp22:巨噬细胞蛋白:互作
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
王真 鲁琳 吴清民
布鲁氏菌病是一种重要的人畜共患病,也是引起动物繁殖障碍的主要疾病之一。近年来,我国人、畜间布鲁氏菌病呈高发态势,严重威胁畜牧业发展和人群身体健康。及时准确诊断对控制和净化布鲁氏菌病具有重要意义。本研究从病原学和血清学两方面对布鲁氏菌病的现有诊断技术进行概述,同时指出布鲁氏菌免疫原性蛋白抗原的筛选和研究,对布病的控制和净化意义重大。
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
张婷婷 刘梦志 冯生 杨江花 叶银波 陈泽良 沈国顺 刘宝山
为获得高纯度布鲁氏菌VirB12蛋白,对VirB12分泌表达蛋白先后进行亲和纯化和离子交换纯化。将其作为抗原包被ELISA板,优化反应条件后初步建立了布鲁氏菌抗体的ELISA检测方法。结果表明:蛋白纯化效果良好,重组蛋白纯度可达到98%以上。在建立的ELISA中,纯化重组蛋白的最佳包被浓度为1μg·mL-1,最适封闭剂为5%脱脂奶粉,血清最佳稀释浓度为1∶25,酶标二抗最佳工作浓度为1∶1500。对20份阳性血清及12份阴性血清的检测结果表明,其与SUANOVIR Brucella-Ab C-ELISA试剂盒的总体符合率达到90.6%,表明本试验建立的以VirB12重组蛋白为抗原的ELISA方法可以检测布氏杆菌感染抗体,有望研制成试剂盒用于养殖场布病的检测和净化。
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
段世宇 杨阳 令狐远凤 杨琦 周碧君
为探究沙门菌外膜蛋白基因fadL、ompN、ybfM以及sRNA RybB和伴侣蛋白Hfq缺失对该菌致病性的影响，构建了鼠伤寒沙门菌基因缺失菌株，并测定了基因缺失菌株的生长曲线，同时通过小鼠腹腔注射测定了基因缺失菌株的毒力及其在小鼠脾脏和肝脏上的定殖能力.结果显示，与鼠伤寒沙门菌亲本野生型菌株LT2相比，基因缺失菌株的生长能力变化不大.LT2对小鼠的LD_(50)为3.97×10~7 CFU;外膜蛋白基因缺失菌株ΔompN、ΔfadL和ΔybfM的LD_(50)分别为1.58×10~5、6.29×10~5、9.97×10~5 CFU,毒性明显增强；sRNA敲除菌株(ΔrybB)的LD_(50)为9.97×10~7 CFU,毒性有所下降；伴侣蛋白Hfq敲除组(Δhfq)及rybB&hfq双敲除组的小鼠死亡数未超过50%,毒性明显下降.感染48 h后，与对照组(LT2)相比，所有基因缺失菌株处理组的脾脏指数均极显著性升高；ΔrybB&Δhfq、Δhfq处理组的脾脏载菌量显著降低，其余菌株处理组的载菌量与LT2差异不显著；ΔrybB、ΔrybB&Δhfq、ΔfadL、ΔybfM处理组的肝脏指数均显著下降，而Δhfq、ΔompN处理组的肝脏指数变化不显著；ΔrybB、ΔfadL处理组肝脏载菌量变化不显著，Δhfq、ΔrybB&Δhfq处理组的肝脏载菌量显著下降，而ΔompN、ΔybfM处理组的载菌量显著上升.总的来说，hfq、rybB缺失降低了鼠伤寒沙门菌的致病力，而fadL、ompN、ybfM的缺失提高了鼠伤寒沙门菌的致病力.
[期刊] 中国农业科学
[作者]
丁家波 王芳 杨宏军 王楠 朱良全 顾进华 张广川 王海光 赵鹏 程君生 毛开荣 冯宇
【目的】对初步鉴定的牛种布鲁氏菌分离株(B.abortus 343)进行全面的生物学特性检定,为深入研究布鲁氏菌病提供参考菌株。【方法】将B.abortus 343划线培养及梯度稀释,使其形成单个菌落,观察菌落形态。挑取单个菌落进行革兰氏染色和柯氏染色,观察其染色特点;分别接种1.5×106 CFU到含硫瑾(1﹕25 000)或含碱性复红(1﹕25 000)的TSA平板上,观察其生长状态;将接种有B.abortus 343的TSA平板分别置于普通培养箱和CO2培养箱37℃培养72 h,观察其对CO2的依赖性;通过醋酸铅试纸条测定B.abortus 343代谢过程中是否释放H2S。通过平板凝集试...
[期刊] 水产学报
[作者]
闵洁 汪开毓 刘韬 贺扬 胡伟 罗梦笛
鲁氏耶尔森菌是一种具有广泛致病性的条件致病肠杆菌。三型分泌系统(T3SS)是该菌的重要毒力系统,其中invF基因是T3SS功能表达的重要调控因子。为探讨invF和T3SS对Y.ruckeri致病作用的影响,本研究构建了Y.ruckeri SC09株invF基因的无痕缺失株,并对其生物学特性进行研究。通过融合PCR方法,将invF基因的上、下游片段A、C融合,构建同源臂AC;将获得的同源臂AC连接入自杀质粒pLP12,构建pLP12-invF同源重组载体;pLP12-invF电转化进入供体菌株大肠杆菌β21
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
王凤雪 冷雪 李真光 温永俊 刘准 武华
根据GenBank上发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)TJ株F3代全基因序列(GenBank登录号为EU860248),结合多个PRRSV亚洲株Nsp2基因比对结果,设计合成引物,选择高致病性PRRSV TJ株噬斑克隆纯化前后14个不同代次,利用合成的引物扩增各代次Nsp2基因的高变区片段及F3代和F92代Nsp2全基因,并进行产物克隆和氨基酸序列分析及结构预测。测序结果表明:PRRSV TJ株在克隆传代过程中出现了序列整段缺失,共缺失120个氨基酸,并且从F18代噬斑克隆开始一直稳定存在。缺失高变区及Nsp2蛋白二级结构预测结果表明:缺失的氨基酸使Nsp2蛋白在空间结构上发生了较大的...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
张剑 马卫明 张亮 何洪彬 丁家波 杨宏军
【目的】布鲁氏菌virb8蛋白是布鲁氏菌的重要毒力因子,本研究拟构建含布鲁氏菌Virb8基因的原核表达载体,利用纯化蛋白作为包被抗原,建立检测牛布鲁氏菌血清抗体的间接ELISA方法(iELISA)。【方法】根据GenBank中的牛型布鲁氏杆菌Virb8序列,设计一对引物,以布鲁氏菌疫苗株S2全基因组DNA为模板扩增Virb8的基因,将目的基因克隆入PEASY-T3,经测序正确后,与载体pET-32a(+)连接,构建重组表达质粒pET-32a-Virb8,转化E.coli BL21(DE3),诱导表达融合蛋白pET-32a-Virb8,经SDS-PAGE及Western-blot分析鉴定后,采用...
关键词：
布鲁氏菌 Virb8 间接ELISA
[期刊] 水产学报
[作者]
储卫华 陆承平
以携带质粒ｐＡＭ１２０（Ａｐｒ、Ｔｃｒ／Ｔｎ９１６）的大肠杆菌ＣＧ１２０株为供体菌，与受体菌嗜水气单胞菌Ｊ－１株，采用滤膜接合法进行接合转移，在选择平板（含Ｔｃ、ｃｆｚ和脱脂奶）上进行筛选，筛选出６株蛋白酶缺失株（ＥＣＰａｓｅ－），ＥＣＰａｓｅ－菌株其生长速度，对正常鲫血清的抗性降低，用脱脂奶平板法及底物法检测，蛋白酶产霞明显降低。与亲本Ｊ－１株相比，突变株致病力降低，对鲫的半数致死量大于１０~８（Ｊ－１株对鲫的半数致死量为５×１０~３）。用ＥＣＰａｓｅ－突变株 ＭＪ－１株的１８ｈ培养物（５ ×１０~６ＣＦＵ）接种健康鲫，不产生亲本 Ｊ－１株引起的病变及死亡。用ＭＪ－１活菌免疫鲫，在第５周产生...
关键词：
嗜水气单胞菌 胞外蛋白酶 Tn916诱变
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
李向阳 王学理 刘凯 霍晓伟 武迎红 张显华
克隆牛布鲁氏菌的甲酰基转移酶基因(Wbkc),在大肠杆菌中表达/纯化,并对甲酰基转移酶的抗原性进行分析。以牛布鲁氏菌的染色体DNA为模板,扩增Wbkc基因,双酶切后克隆至pET-28a上,在大肠杆菌BL21中诱导表达,His Trap FF层析柱纯化,Western blot鉴定甲酰基转移酶的抗原性。提取的重组质粒经PCR鉴定、双酶切鉴定和测序分析确定目的基因成功插入到了克隆载体中。SDS-PAGE分析证明,表达产物为相对分子质量29 000的融合蛋白。Western blot结果表明,表达的蛋白具有特异的免疫反应原性。
[期刊] 浙江农林大学学报
[作者]
邵若玄 沈忆珂 周文彬 方佳 郑炳松
ABC(ATP-binding cassette)转运蛋白家族庞大,种类繁多,包括全转运子和半转运子等2种类型。全转运子的核心单元包括2个核苷酸结构域(NBD)和2个跨膜结构域(TMD),而半转运子只含有1个膜结构域(MSD)和1个NBD。植物ABC转运蛋白不仅参与植物体内激素、脂质、金属离子、次生代谢物和外源物质的运输,并且有利于植物与病原体间的相互作用和植物体内离子通道调控等重要的生理过程的进行,是一类重要的跨膜运输蛋白家族。HUGO系统中ABC家族分为A～H 8个亚族,模式植物基因组测序的完成极大促进了ABC转运蛋白的研究与发现,近几年已从多种植物中克隆了不同亚族的基因并研究其表达与功能...
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