为探究泥鳅ELOVL1的功能和作用,采用RT-PCR和RACE方法克隆泥鳅的elovl1基因,并分析elovl1基因的表达规律,最后将泥鳅分别暴露在26℃和8℃下饲养30d,研究低温胁迫对泥鳅脂肪酸组成、组织形态及elovl1基因表达的影响。结果发现:elovl1a全长为2 216bp,ORF为948bp,编码315个氨基酸;elovl1b全长为1 895bp,ORF为963bp,编码320个氨基酸。氨基酸序列特征如下:1个高保守的氧化还原组氨酸簇(HXXHH),多个跨膜区,氨基酸序列C端均含有内质网滞留信号(KXKXX)。elovl1a和elovl1b在所有组织中表达,elovl1a在每个组织的表达量均低于elovl1b。低温下总SFA明显降低(P<0.05),总MUFA显著增加(P<0.05)。低温显著诱导elovl1a、elovl1b表达。研究结果表明:泥鳅ELOVL1在脊椎动物中保守,ELOVL1可能在机体适应低温时,参与产生能量,起到重要的作用。

为探究泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)脂肪酸延长酶2和延长酶5基因(elovl2,elovl5)在长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)合成中的作用,克隆获得泥鳅elovl2和elovl5基因cDNA全长序列,分析其在泥鳅不同组织中的表达规律;通过酵母体外表达验证其延长活性;并投喂以鱼油(FO)、亚麻芥油(CO)和大豆油(SO)为脂肪源的饲料8周,分析不同脂肪源对泥鳅elovl2和elovl5表达的影响。结果显示,泥鳅elovl2和elovl5的开放阅读框(ORF)分别为888bp和876bp,编码295和291个氨基酸。系统进化树分析表明泥鳅ELOVL2、ELOVL5和斑马鱼的同源性最近。序列比对分析ELOVL2和ELOVL5保守性较高,都具有长链脂肪酸延伸酶的特殊结构。泥鳅elovl2和elovl5均在肝组织中表达量最高。酵母功能验证结果表明泥鳅ELOVL2主要延长C20-22PUFA,而ELOVL5主要延长C18-20PUFA,对C22PUFA没有延长作用。不同饲料脂肪源投喂试验结果显示,CO组泥鳅肝脏和肌肉n-3PUFA含量显著上升,肌肉20∶5n-3含量显著升高,但肝脏和肌肉22∶6n-3含量没有显著变化。CO组泥鳅肝组织中elovl2、elovl5、scd和srebp-1c的表达量也显著上升。综上所述,泥鳅ELOVL2和ELOVL5在LC-PUFA合成中具有重要作用,饲料中CO添加可促进泥鳅n-3PUFA的积累。

克隆甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)低温胁迫基因Ib ICE1,对其进行序列分析及低温胁迫下表达水平分析,探讨Ib ICE1对甘薯耐低温胁迫能力的影响。以辽薯36为试验材料,利用RACE技术克隆甘薯Ib ICE1基因,Ib ICE1基因的c DNA全长2150bp,包含1611bp完整的开放阅读框,该基因编码536个氨基酸残基,分子量58.26 k D,等电点5.72。进化树分析表明,Ib ICE1同玉米和拟南芥ICE1基因亲缘关系较近。Ib ICE1蛋白C端含有一个典型的b HLH

克隆并分析泥鳅cyp19a1a的全长cDNA和5′侧翼序列,用qRT-PCR技术比较cyp19a1a在二倍体、四倍体泥鳅组织间和倍性间的表达差异。结果发现,泥鳅cyp19a1a的cDNA全长1 905 bp,包括29 bp的5′TR、301 bp的3′UTR和1 575 bp的ORF序列,其氨基酸序列中存在I-螺旋区、芳香化酶特异保守区以及血红素结合区等重要功能域。用hiTAIL-PCR克隆获得2 040 bp的5′侧翼序列,在该序列上预测到典型元件TATA-box,以及C/EBPβ、SRY、ER、CREB、GR等转录因子结合位点。12月龄四倍体泥鳅的体长、体质量均显著高于二倍体,但性腺发育明显滞后于二倍体。cyp19a1a和cyp19a1b分别在二倍体、四倍体泥鳅的性腺和脑中的表达量最高。倍性间比较结果显示,cyp19a1a在四倍体各组织中的表达均高于二倍体(除精巢外);cyp19a1b在四倍体雌鳅脑中的表达量显著高于二倍体,但在四倍体雄鳅脑中的表达量显著低于二倍体。综合分析上述结果,四倍体中相对较高的cyp19a1a表达可能与其性腺所处发育时期有关,较晚的性成熟有利于泥鳅将更多能量用于个体生长。由于cyp19a1及其催化产生的雌激素还可以通过GH-IGF通路调节鱼类的生长,推测cyp19a1在泥鳅倍性间的差异表达可能与二倍体、四倍体间的生长生殖差异密切相关。

肿瘤坏死因子受体相关因子7 (tumor necrosis factor receptor associated factor7， TRAF7)作为一种细胞内蛋白，参与信号转导，并介导宿主应激防御调控过程。为研究TRAF7在刺参(Apostichopus japonicus)高温胁迫中的作用，本研究利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)和实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)，克隆了刺参TRAF7 (AjTRAF7)全长cDNA序列，分析了其结构特征和在基因组中的分布，并检测了该基因在刺参不同组织和高温胁迫过程中体壁组织中的表达变化情况。结果显示，AjTRAF7全长2 576 bp，开放阅读框(ORF)长1 770 bp，5′UTR长345 bp，3′UTR长461 bp，编码589个氨基酸，预测蛋白分子量为65.6 kDa，理论等电点(pI)为7.52。蛋白序列包含1个RING finger结构域、1个Coiled coil结构域和6个WD40结构域，N端包含1个螺旋区域。该基因预测蛋白包含41个丝氨酸磷酸化位点、20个苏氨酸磷酸化位点和3个酪氨酸磷酸化位点，蛋白N端具有3个天冬酰胺糖基化位点。刺参基因组中比对到2个AjTRAF7基因拷贝，位于同一条染色体上，第一个拷贝包含18个外显子和15个内含子，第二拷贝包含17个外显子和14个内含子。系统进化学分析表明，刺参TRAF7氨基酸序列与蝠海星(Patiria miniata)和紫色球海胆(Strongylocentrotus purpuratus)相似性较高，分别为40.58%和38.37%，刺参与蝠海星和紫色球海胆聚在一支。qRT-PCR结果显示，AjTRAF7在健康刺参各组织中均有表达，其在雌性性腺中表达量最高，体腔细胞中表达量次之，在呼吸树、体壁、肠道、雄性性腺和纵肌中表达量依次降低，各组织间表达量差异显著(P<0.05)。在响应高温胁迫的过程中，与对照组相比，体壁组织中AjTRAF7基因表达量在第2天和第4天表达显著上升(P<0.05)，第6天基因表达开始下降。综上，AjTRAF7基因可能参与刺参应对高温胁迫的表达调控过程，相关结果将为解析刺参应对高温胁迫的分子机制提供科学依据。

【目的】蛋白磷酸化在介导非生物逆境信号的转导中具有重要作用。以笔者在低磷胁迫下鉴定的小麦促分裂原活化蛋白激酶(MAP激酶)基因TaMPK1a-1为基础,开展该基因应答低磷逆境分子特征的研究。【方法】利用cDNA-AFLP技术,鉴定特异上调表达的MAP激酶基因TaMPK1a-1。采用生物信息学技术研究基因结构和编码蛋白特征,采用半定量RT-PCR技术研究TaMPK1a-1应答低磷胁迫逆境的分子特征。【结果】TaMPK1a-1 cDNA长度为2170bp,开放阅读框为1737bp,编码578个氨基酸残基。TaMPK1a-1含有2个参与双重磷酸化作用的TEY和TDY基序。在正常供磷条件下,磷高效品种...

从低温诱导的巨桉幼苗中克隆到2条CBF的全长cDNA序列,命名为EgrCBF1和EgrCBF2,全长分别为1062bp和1203bp,编码220个氨基酸和196个氨基酸,命名为EgrCBF1和EgrCBF2(GenBank登录号分别为:JQ068827;JQ068828),都包含1个AP2结构域。2个基因编码的蛋白都与冈尼桉中CBF蛋白(DQ241820)具有很高的同源性,与EguCBF1a的同源性分别达到了91%和80%。RT-PCR分析表明,EgrCBF1主要在叶和根中表达,而EgrCBF2在叶、茎和根中都有表达。对不同低温条件(0,2,4,6,8℃)和4℃2,4,8,24,48h处理下E...

蜡质诱导因子1(wax inducer 1/SHN1, WIN1/SHN1)与植物的抗逆性密切相关。为研究WIN1在耐旱经济灌木扁果枸杞(Lycium barbarum ssp. Bianguo)中的功能及其应用前景，本研究用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从扁果枸杞中克隆了LbWIN1，构建了LbWIN1融合增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的载体并表达在拟南芥(Arabidopsis thaliana)原生质体中进行亚细胞定位，用实时荧光定量PCR法(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)分析LbWIN1的表达特征。结果表明，LbWIN1基因长1 103 bp，含600 bp的开放阅读框，编码199个氨基酸，含有1个高度保守的AP2结构域。系统进化树分析发现，LbWIN1蛋白与茄科番茄(Solanum lycopersicum) SlWIN1和辣椒(Capsicum chinense) CcWIN1的同源性高达99%。亚细胞定位分析证明LbWIN1蛋白定位于细胞核。LbWIN1基因在叶、茎、根中均表达，其表达量受NaCl、渗透胁迫和外源脱落酸(ABA)诱导，表明LbWIN1参与旱生植物响应盐和干旱等非生物胁迫。

钙调蛋白是植物体内一种重要的Ca~(2+)受体蛋白，在钙信号途径及抗逆反应中发挥着重要作用。为研究番茄CaM蛋白在低温胁迫下的作用机制，以番茄品种Heinz1706、LA3969、冀粉2号、冀粉3号和农博粉霸15为材料，克隆得到了番茄钙调蛋白基因SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5,并进行序列分析和启动子区顺式作用元件分析；利用qRT-PCR技术分析SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5在不同番茄品种中15,5℃低温胁迫下的表达模式，并结合RNA-seq数据分析组织特异性表达情况。结果显示，SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5的CDS序列均为450 bp,三者相似度为93.63%;所编码的氨基酸序列完全相同，属酸性稳定亲水蛋白，具有典型的CaM蛋白保守结构域。启动子顺式作用元件分析表明，3个基因的启动子区除含有必需的核心元件外，还含有多种生物及非生物胁迫响应元件，并呈现互补模式分布。不同程度低温胁迫表达模式分析表明，15℃胁迫下，SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因在5种番茄材料中的表达模式均呈现出先降低后升高的趋势，其中SlCaM5基因的表达量升高更为显著；5℃胁迫下，SlCaM3、SlCaM4基因的表达水平变化不明显，而SlCaM5基因在处理后期表达量显著升高；表明SlCaM5在低温下维持着CaM蛋白的翻译水平。SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因在Heinz1706不同组织中的特异性表达情况显示，SlCaM3和SlCaM4在分生组织中具有较高的表达，而SlCaM5基因在不同组织中表达水平差异不明显。

肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)是动物肌肉生长发育的负调控因子。以泥鳅肌肉cDNA为模板,采用RT-PCR方法克隆了泥鳅MSTN基因的主要片段,其长度为815bp,编码271个氨基酸残基。泥鳅MSTN具有MSTN的共同特征,有蛋白酶水解位点RIRR和保守的半胱氨酸残基。RT-PCR分析表明该基因在肌肉中显著表达,在眼中也有微弱表达,而在其他所检测组织(脑、鳃、心脏、肝脏、肠、精巢、卵巢)未见表达。此结果表明泥鳅MSTN基因除对肌肉生长发育有调控作用以外,还可能在眼的发育中有一定作用。

【目的】筛选并克隆与水分胁迫相关的基因,通过对目的基因的表达分析进一步解析植物的抗旱机制,为甘蔗抗逆育种提供候选基因和理论依据。【方法】应用消减文库技术结合cDNA芯片技术筛选水分胁迫诱导的基因的EST序列,根据筛选到感兴趣的上调表达基因的EST序列,用RACE技术获得SSADH的全长cDNA序列,并通过实时荧光RT-PCR技术对该基因的表达特征进行分析。【结果】通过消减文库技术结合cDNA芯片技术筛选的EST中含有4个推测为基因SSADH的EST,其在水分胁迫处理的斑茅中均明显上调表达。通过RACE扩增获得甘蔗SSADH全长cDNA序列为1914bp,其中5′端非编码区25bp,开放阅读框为...

【目的】克隆蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)低温胁迫响应基因MtbHLH-1,并对其进行序列特征分析,研究MtbHLH-1对牧草蒺藜苜蓿耐低温能力的影响。【方法】利用RT-PCR技术获得蒺藜苜蓿MtbHLH-1全长的cDNA序列。对该序列进行生物信息学分析,采用半定量RT-PCR研究MtbHLH-1的低温(4℃)表达模式。【结果】测序结果显示,cDNA片段全长778 bp,包含一个741 bp完整的开放阅读框,编码246个氨基酸残基,命名为MtbHLH-1,GenBank登录号为JN800447。氨基酸BLAST分析表明,MtbHLH-1氨基酸序列与已报道的其它植物(大豆、拟...

本研究利用RACE方法克隆获得三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)凋亡蛋白酶激活因子-1(Apoptoticproteaseactivatingfactor-1,Apaf-1)基因,该基因c DNA全长为2032bp,其中,ORF为1050 bp,编码349个氨基酸,预测分子量为39.13 kDa,理论等电点为7.67。同源性和系统发育分析显示,Apaf-1与凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)Apaf-1的同源性最高,为51.27%,并与凡纳滨对虾聚为一支。组织表达分析显示,Apaf-1基因的相对表达水平在肝胰脏最高,其次是肌肉、心脏、鳃和眼柄,血细胞和表皮最低。不同盐度胁迫后,Apaf-1在Ⅱ期幼蟹体内表达水平在3 h达到最大值,此后,呈先下降再上升趋势;Apaf-1在80日龄盐度20胁迫后三疣梭子蟹的鳃中呈上升趋势,在肝胰腺中为先上升后下降趋势,表明盐度改变能影响该基因在鳃和肝胰腺组织中的表达。不同病原感染实验结果显示,在血细胞中,注射副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)后Apaf-1的表达于48 h到达峰值,为对照组的2.76倍(P<0.05),注射WSSV后在12h到达峰值,为对照组的5.89倍(P<0.05),整体呈上调表达趋势。本研究为进一步理解三疣梭子蟹Apaf-1基因的生理功能提供了参考。

克隆马尾松Ｐｉｎｕｓ ｍａｓｓｏｎｉａｎａ水通道蛋白（ａＱＰ），并对其生物信息学与干旱胁迫表达模式进行分析。采用逆转录聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）以及互补脱氧核糖核酸（Ｃ Ｄｎａ）末端快速扩增（ＲａＣＥ）方法克隆马尾松水通道蛋白基因。采用实时荧光定量聚合酶链式反应（Ｑ ＲＴ－ＰＣＲ）分析其在干旱胁迫下的响应模式。结果克隆到一个马尾松水通道蛋白基因，命名为Ｐｍ ＰｉＰ１（ＧＥｎ Ｂａｎｋ登录号为ｋＦ５８２０３８）。此基因Ｃ Ｄｎａ全长序列为１ ３０１ ＢＰ，包括８６７ ＢＰ的完整开放阅读框，９９ ＢＰ的５′末端非翻译区和３３５ ＢＰ的３′末端非翻译区。编码２８８个氨基酸残基，分子量为３０．８６．．．

为了研究类固醇激素合成急性调节蛋白 (StAR)在日本沼虾应答低氧胁迫过程中所发挥的作用，实验应用cDNA末端快速扩增 (RACE) PCR技术克隆了日本沼虾StAR全长cDNA序列，并利用在线软件对其序列特征进行生物信息学分析，采用半定量RT-PCR方法分析StAR在日本沼虾不同组织的分布情况，采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)与Western blot技术对其在不同低氧胁迫阶段中的表达规律进行检测，观察低氧胁迫下精巢组织中StAR蛋白免疫组化定位。结果显示，日本沼虾StAR其cDNA全长3 361 bp (NCBI登录号：MW263908)，包括5′-UTR 323 bp，3′-UTR 2 129 bp，开放阅读框909 bp，编码302个氨基酸。氨基酸序列比对及系统进化分析结果显示，日本沼虾StAR基因与三疣梭子蟹等甲壳动物StAR聚类一支，具有最近的亲缘关系。半定量RT-PCR检测结果显示，StAR在日本沼虾不同组织中均有表达，其表达量在肝胰腺和心脏组织中最低，在精巢组织中表达处于较高水平。使用qRT-PCR技术检测日本沼虾精巢中StAR在低氧胁迫下时空表达情况，结果表明，与对照组相比，低氧处理组精巢中StAR基因表达量在1～48 h均显著上调，而在低氧处理组96 h显著降低。此外，本实验对StAR进行了原核表达及抗血清制备，采用Western blot检测StAR蛋白表达丰度基本与基因表达模式相似，免疫组化结果显示，StAR 蛋白在精细胞与间质细胞中均有表达。综上所述，长期低氧胁迫显著降低了StAR基因的转录表达水平，并且该基因可能在类固醇合成路径及精子发生过程中均发挥重要作用。本研究结果为进一步解析日本沼虾类固醇激素合成分子机制奠定基础。