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[期刊] 西南农业学报
[作者]
焦展 安胜军 邵铁梅 仵陶 李雪 刘培 高维娟 柴锡庆
为建立并研究利用油葵油体表达系统表达重组人胰岛素蛋白的方法，采用ＰＣＲ技术构建植物种子特异性表达载体，经花粉管通道用重组人胰岛素基因转化油葵。利用ＰＣＲ法检测目的基因的转化情况，用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＷＥＳｔＥＲｎ ｂｌｏｔ对胰岛素蛋白的表达进行鉴定。结果表明，合成了重组人胰岛素与花生油体蛋白融合基因，并获得植物种子特异性表达载体Ｐ ｂＩｎｏＩ。花粉管通道转化油葵的适宜条件为，花柱剪切１／２，质粒浓度为５０～１００ ｎＧ／μｌ转化效率最高。ＰＣＲ结果显示，油葵花粉管通道法转胰岛素基因总转化率为３．２％，温室转化率（５．２０％）高于大田转化率（１．１２％）。获得ｔ１～ｔ５代转基因种子，播种为ｔ１～．．．
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
张家荣 秦宏宇 谢婷 张效宇 李飞霞 吕俊贤 贾玉东
类胰岛素生长因子3 (insulin-like growth factor 3， IGF3)在硬骨鱼类性别分化过程中扮演重要角色，但其是否影响卵巢发育尚不明确。本研究以欧亚养殖良种大菱鲆(Scophthalmus maximus)为实验材料，通过RACE (rapid-amplification of cDNA ends)克隆技术，获得了IGF3全长cDNA序列，分析了其生物信息学特征，预测了其与IGF特异性受体(IGF receptors， IGF-1R， IGF-2R)结合情况，查明了其组织和卵巢不同发育时期表达规律。结果显示，大菱鲆IGF3 cDNA全长为1 255 bp，编码259个氨基酸。生物信息学分析发现，IGF3为亲水性蛋白，具有典型的IGF特异性结构域和信号肽序列，同大西洋庸鰈(Hippoglossus stenolepis)同源性最高；蛋白质三级结构域由3个α螺旋串联而成，同IGF-1R和IGF-2R紧密结合。组织表达分析显示，igf3在大菱鲆各个组织中均有分布，雌、雄大菱鲆表达规律显著不同，但皆在脑组织中表达最高。在卵巢发育过程中，igf3在卵黄生成后期表达量显著上升，在核迁移期达到最高，在闭锁期显著下降。以上结果表明，大菱鲆IGF3具有典型的IGFs家族结构特征，作为局域性内分泌因子，在组织中广泛分布且具有显著的性别二态性，同时参与调控了卵巢发育和成熟。相关结果为深入解析IGF3对大菱鲆卵巢发育和卵母细胞成熟的影响及其作用机制奠定了基础，同时也为探究鱼类IGF3新功能提供了重要思路。
[期刊] 水产学报
[作者]
赵晓杰 陈松林 王娜 王贤丽 邢士超
通过RT-PCR方法从大菱鲆肝组织克隆了胰岛素样生长因子-I(IGF-I)成熟肽片段,分析表明,此成熟肽由70个氨基酸残基组成,含有3个链内二硫键。将扩增片段克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,实现了IGF-I成熟肽和GST蛋白在Escherichia coli BL21(DE3)plysS中的融合表达。融合蛋白分子量约为34ku,诱导4h时占菌体总蛋白的59%,主要以包涵体形式存在。Western-blotting免疫印迹表明,融合蛋白可以特异性地被anti-GST抗体识别。包涵体经6mol/L盐酸胍变性溶解及脉冲法稀释复性后,通过GSTrapFF亲和预装柱纯化,获得了电泳分析纯的融合蛋...
[期刊] 水产学报
[作者]
叶星 白俊杰 劳海华 简清 李英华 罗建仁
采用PCR方法改造已克隆到的草鱼胰岛素样生长因子 Ⅰ (IGF Ⅰ )cDNA ,使其成为成熟肽cDNA并亚克隆到pGEX 4T 1载体中 ,构建草鱼IGF I融合蛋白表达质粒pGEX IGF。质粒转化大肠杆菌BL2 1菌株。该菌株经IPTG诱导可表达分子量约 34kD的特异蛋白。在不同的温度条件下分别产生以可溶性的和包涵体形式为主的特异蛋白。经 30℃诱导的菌体经溶菌酶消化、超声破碎及高速离心后 ,裂解液上清经glutathionesepharose亲和层析纯化获得高纯度的GST IGF。以此纯化的融合蛋白为抗原制备兔抗草鱼IGF I的抗血清。凝胶双扩散试验显示抗血清效价为 1∶6 4 ,...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
王京京 魏麟 陈斌
克隆猪胰岛素诱导１（ＩＮＳＩＧ１）基因，并对其蛋白质序列进行分析。根据人ＩＮＳＩＧ１基因的保守序列设计１对引物，以猪总ＲＮＡ为模板，经ＲＴ–ＰＣＲ获得ＩＮＳＩＧ１基因序列，通过相对荧光定量ＰＣＲ分析该基因在不同组织中的表达量；将ＩＮＳＩＧ１基因序列连接到ＰＭＤ１９–Ｔ ＳＩＭＰｌｅ载体上，用ＰＣＲ检测阳性克隆后测序，并对克隆得到的基因进行生物信息学分析。结果表明，ＩＮＳＩＧ１基因在肺中的表达量最高，其次是在肝脏，再次是在脾脏，在心脏中的表达量最低；通过克隆，获得了一段９９９ ｂＰ的序列，其中８３１ ｂＰ的开放阅读框编码２７６个氨基酸；该蛋白不含信号肽序列，与其他动物ＩＮＳＩＧ１基因氨基酸序列的．．．
关键词：
猪 胰岛素诱导1基因 基因克隆 序列分析
[期刊] 淡水渔业
[作者]
杨长庚 苏富强 文华 刘伟 魏开金
为探讨饲料中不同蛋白源(菜籽粕、发酵豆粕、鸡肉粉、肉骨粉)替代50%鱼粉对克氏原螯虾(Procambarus clarkii)生长、消化酶活性及生长轴基因表达的影响。以克氏原螯虾(9.84±0.49)g为研究对象,将其分为5组(对照组、菜籽粕组、发酵豆粕组、鸡肉粉组、肉骨粉组),分别投喂不同蛋白源的实验饲料,养殖周期6周。结果显示:发酵豆粕组的增重率最高,但与对照组差异不显著;菜籽粕组的增重率显著低于对照组。发酵豆粕组、鸡肉粉组和肉骨粉组的肝胰脏蛋白酶活性与对照组差异不显著,菜籽粕组肝胰脏蛋白酶活性显著性低于对照组;发酵豆粕组脂肪酶活性最高,但与对照组差异不显著。发酵豆粕组小肠的胰岛素生长因子受体(IGF1R)相对表达量与对照组差异不显著,但显著高于其他三组;菜籽粕组、发酵豆粕组和肉骨粉组肝脏的IGF1R相对表达量显著高于对照组。结果表明:比较4种蛋白源替代50%鱼粉,发酵豆粕效果最佳,肉骨粉和鸡肉粉次之,菜籽粕最差。
[期刊] 淡水渔业
[作者]
商汉桥 罗晓松 邹世平 伍晓雄 吴小平 龙良启
从鲤(Cyprinus carpio)肝脏总RNA中成功地克隆和诱导表达了胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)基因,并用间接ELISA法和Western-blot对其融合蛋白的多克隆抗体的效价和特异性进行了分析。结果表明,克隆的鲤IGF-Ⅱ基因与已报道的序列相比,有1个位点发生同义突变;经SDS-PAGE电泳分析,目的蛋白主要以包涵体的形式存在,表达量占菌体总量的35%。经ELISA测定,制备的抗体效价为6400。Western blot分析表明,抗血清能与重组蛋白发生特异性反应
[期刊] 水产学报
[作者]
任付真 姚韩韩 钱雪骏 林志华 董迎辉
为了研究IGF1R基因在泥蚶生长、发育过程中的调控作用,本研究基于泥蚶转录组文库的EST,利用SMART RACE技术首次克隆获得泥蚶IGF1R基因(Tg-IGF1R)c DNA全长序列,该序列全长为5793 bp,开放阅读框为4638 bp,编码1546个氨基酸。经生物信息学分析发现,该基因5′端非编码区为810 bp,3′端非编码区为345 bp,Tg-IGF1R蛋白分子量为176.01 ku,等电点为6.04,包含4个Ⅲ型纤粘连蛋白结构域,1个半胱氨酸富集区和1个酪氨酸激酶结构域,属于亲水性跨膜蛋白
[期刊] 中国农业科学
[作者]
赵益文 赵佳 庞全海
【目的】研究褪黑素对大鼠胰岛瘤细胞INS-1中胰岛素和Gαi/o蛋白基因表达的影响,探究褪黑素在m RNA水平对Gαi/o和Insulin1调节作用中可能存在的分子机制。褪黑素(melatonin,MT)是松果腺分泌的一种吲哚类神经内分泌激素,在机体内可调节胰岛素的分泌而使其呈现昼夜节律性分泌,影响葡萄糖昼夜代谢水平的变化进而维持机体血糖的相对恒定,故对于褪黑素影响胰岛素表达的研究可能会对褪黑素在胰岛素昼夜节律性分泌中的调控作用提供依据。【方法】将冻存的INS-1细胞复苏培养至第三代,INS-1细胞传代后
[期刊] 中国水产科学
[作者]
吴秀梅 徐黎明 赵景壮 刘淼 曹永生 卢彤岩 尹家胜
在鱼类胚胎发育过程中,胰岛素样生长因子-II(insulin-like growth factors-II,IGF-II)起着关键的作用。本研究根据Gen Bank收录的鲑鳟鱼IGF-II基因序列设计引物,以哲罗鱼(Hucho taimen)肝RNA提取物为模板,利用RT-PCR方法扩增出哲罗鱼IGF-II基因开放阅读框。将目的基因IGF-II与原核表达载体p SUMO连接构建出重组表达载体p SUMO-IGF。将该重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta中进行目的蛋白的诱导表达。SDS-PAGE电泳分析显示,约在40 k D处含有清晰的条带,与预期结果相符;目的蛋白以包涵体形式存在。对包涵体进行...
[期刊] 水产学报
[作者]
王晓玉 徐黎明 刘淼 赵景壮 卢彤岩 曹永生 尹家胜
为进一步了解哲罗鲑ＩＧＦ－Ｉ，实验采用逆转录聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法，从哲罗鲑肝脏的总ＲＮＡ中扩增出胰岛素样生长因子－Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）的Ｃ ＤＮＡ开放阅读框（ｏＰｅＮ ＲｅＡＤＩＮＧ ＦＲＡｍｅ，ｏＲＦ）序列。利用原核表达载体Ｐ Ｓ构建重组表达质粒（ＩＧＦ－Ｉ／Ｐ Ｓ），并将其转化到宿主大肠杆菌ＲｏＳｅＴＴＡ后经ＩＰＴＧ诱导获得重组哲罗鲑ＩＧＦ－Ｉ蛋白。经ＳＤＳ－ＰＡＧｅ电泳检测，在３５～５０ ｋｕ有条带与预期相符，且重组蛋白以包涵体的形式存在。包涵体经变性／复性实验后，获得纯化的ＩＧＦ－Ｉ融合蛋白。ｅＬＩＳＡ鉴定结果显示，目的蛋白能特异性识别抗鱼类ＩＧＦ－Ｉ抗体，表明获得了具有免疫．．．
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
苏曼文 张晓军 袁剑波 张小溪 杨铭 李富花
类胰岛素肽(ILP)是胰岛素超家族的成员，具有进化保守性，是影响动物生命活动的重要因子之一。本研究克隆了凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei) ILP1全长基因，mRNA长度为812 bp，其中开放阅读框长543 bp，编码180个氨基酸。序列分析显示，LvILP1蛋白预计分子量为20.81 kDa，理论等电点为9.45，不稳定系数为96.20，具有一个信号肽，没有跨膜结构，推导其为碱性、不稳定的分泌蛋白。结构预测发现，该蛋白具有胰岛素超家族保守的IlGF结构域，由N端信号肽、B链、C肽和A链组成，同时具有6个保守的半胱氨酸位点和2个断裂位点。系统进化分析发现，LvILP1与斑节对虾(Penaeus monodon) ILP7亲缘关系最近，与甲壳动物ILP1聚为一支，然后分别与无脊椎动物ILP7、脊椎动物松弛素(Relaxin)、胰岛素(Insulin)、胰岛素样生长因子(IGF)聚在一起。无脊椎动物ILP7类与外群海葵(Actinia tenebrosa) ILP的进化关系最近，表明这类ILP可能与胰岛素超家族的祖先较为相似。转录因子预测发现，LvILP1可能的转录因子为叉头框蛋白O3 (FoxO3)、糖皮质激素受体(GR)、CAAT区/增强子结合蛋白(C/EBP)、信号传导及转录激活蛋白(STAT)等；蛋白互作分析发现，LvILP1与细胞膜上的胰岛素受体(IR)、神经信号分子(VGLUT1、SYT 1＿3)、糖蛋白激素(GPHB5)、鞣化激素(Bursicon)等相互作用；对这些转录因子和互作蛋白的生物功能进行分析，进而推测LvILP1可能具有调节生长发育、激素刺激反应、神经系统稳态、碳水化合物稳态、蜕皮后组织重建以及生殖发育等作用。分析发现，LvILP1在凡纳滨对虾早期发育阶段有较高表达，在成体各个组织中均有表达，但在眼柄中表达量最高。本研究结果为深入了解凡纳滨对虾ILP的基因结构、进化、功能及表达提供了重要信息，同时为凡纳滨对虾的分子育种和健康养殖提供线索。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
殷冬梅 杨海棠 台国琴 杨秋云 崔党群
【目的】培育高油酸的花生新种质。【方法】以根癌农杆菌为介导将含有油酸脱氢酶基因的植物双元表达载体pFGC/2nd转入花生外植体丛生芽,通过卡那霉素筛选,器官发生再生转化植株;荧光定量PCR检测转基因植株。【结果】丛生芽外植体于OD600为0.6的农杆菌菌液中浸泡8～10min后,在MS培养基上暗培养3d效果较好。诱导筛选培养3个月左右,共得到16株转化植株,其中11个转基因植株经PCR检测呈阳性,说明外源基因已整合进入受体植物。进一步的荧光定量PCR检测显示,有4个植株基本上不表达或表达量很低。【结论】建立花生丛生芽遗传转化体系;RNA干扰对内源的油酸脱氢酶基因产生了抑制作用。
[期刊] 水产学报
[作者]
田娟 涂玮 曾令兵 文华 蒋明 吴凡 刘伟 杨长庚
在室内可控条件下,对尼罗罗非鱼[初始体质量(62.50±3.44)g]进行饥饿28d和随后再投喂21d的处理,于饥饿第0、7、14、21、28天和再投喂第14、21天进行采样分析,研究饥饿和再投喂期间尼罗罗非鱼生长、血清生化指标和肝胰脏生长激素(GH)、类胰岛素生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)和胰岛素(IN)mRNA表达丰度的变化。结果显示,与饥饿第0天相比,饥饿超过7d鱼体体质量显著降低(P<0.05),再投喂21d显著增加(P<0.05);肝体比随饥饿时间延长显著降低(P<0.05),恢复投喂后较饥饿时升高,但显著低于饥饿前水平(P<0.05)。在血清指标上,甘油三酯、血糖、碱性磷酸酶、谷草转氨...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
胡小丽 张春林 王加启 赵圣国 章玉涛 卜登攀 周凌云
【目的】采用real-time PCR方法检测体外激素处理对奶牛乳腺上皮细胞FcRn(neonatal Fc receptor,FcRn)mRNA表达的影响。【方法】在乳腺上皮细胞培养液中添加不同浓度胰高血糖素(0.01、0.1和1μmol.L-1)、胰岛素(0.005、0.1和0.5μmol.L-1)、甲状腺素T4(0.01、0.1和1μmol.L-1),体外培养并收集细胞,提取细胞mRNA后,利用real-time PCR检测FcRn mRNA的相对丰度。【结果】在一定添加剂量范围内,随着添加剂量的增加,甲状腺素和胰高血糖素能够显著地促进FcRn mRNA表达量升高(P<0.05),胰岛素...
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