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[期刊] 西南农业学报
[作者]
赵传志 苏磊 李爱芹 夏晗 李长生 王兴军
克隆大豆油体蛋白特异启动子及油体蛋白基因的全长序列,利用连接PCR的方法,通过一个肠肽酶位点将人成骨蛋白成熟肽编码序列连接到油体蛋白基因3’端并克隆到表达载体pCAMB IA1302中,构建"油体蛋白-肠肽酶-人成骨蛋白"植物表达载体。通过酶切、PCR和测序鉴定,证明表达载体构建成功,将其命名为pCAM-oleo-Bmp7。通过蛋白分析软件DNAstar、S ignalP3.0和ProtComp v8.0等软件对重组蛋白的理化性质、二级结构、信号肽和细胞定位进行了分析和预测,证明融合蛋白很好的保留了原来两个蛋白的二级结构和理化性质。
[期刊] 华北农学报
[作者]
李君武 宫君原 刘鑫 叶秋萍 黄清华
构建包含编码结核杆菌Esat6基因和乙肝病毒大包膜蛋白(L蛋白)基因的植物双元表达载体,并转化根癌农杆菌LBA4404。分别以质粒pPIC9K-L和结核杆菌基因组为模板进行PCR扩增,获得L和Esat6基因,然后运用部分重叠聚合酶链式反应扩增出L-Esat6融合基因片段,连接到有玉米特异性启动子globulin-1的pEGG载体上,将G-L-Esat6融合基因片段酶切下,连接到含有抗除草剂基因bar的双元表达载体pCAMBIA1300上,电击法将重组质粒转化到农杆菌LBA4404中。构建了真核表达重组质粒pCAMG-L-Esat6,测序分析表明,克隆的L和Esat6序列与NCB I上公布序列一...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
周勇 曾令兵 范玉顶 罗晓松 徐进 肖艺
根据GenBank中草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV)VP6蛋白的全基因序列(AF403394)和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的基因序列(M17874),设计并合成特异性引物,从感染草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肾细胞(CIK)中提取病毒核酸作为模板,进行RT-PCR扩增,得到约1.3 kb的GCRV VP6基因读码框片段,同时提取大肠杆菌(Escherichia coli)H44815全基因组作为模板,进行PCR扩增得到约370 bp的LTB基因读码框片段。将获得的2个目的片段分别克隆到pCR2....
[期刊] 华北农学报
[作者]
贺建华 李文利 魏立君 夏秀英
人β淀粉样蛋白(Amyloidβ peptide,Aβ)是治疗阿尔茨海默氏病(Alzheimer′s disease,AD)的关键靶标之一。本试验利用重叠PCR技术获得2Aβ串联基因片段,并将其克隆到植物表达载体pBIDST(含双35S启动子和TEV增强子)中。用根癌农杆菌EHA105介导转化烟草,筛选获得了卡那霉素抗性植株。PCR和RT-PCR检测结果证实2Aβ基因已经整合进烟草基因组中并进行了转录。
关键词：
β淀粉样蛋白 植物表达载体 转基因烟草
[期刊] 淡水渔业
[作者]
周勇 范玉顶 徐进 李艳秋 肖艺 曾令兵
以据草鱼呼肠孤病毒(GCRV)VP6蛋白的全基因序列(GeneBank AF403394)为模板,采用RT-PCR构建了草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白基因植物表达载体的构建。结果显示:实验构建的pCR 2.1-VP6重组质粒含有NcoⅠ和BglⅡ酶切位点;pCR 2.1-VP6重组质粒经PCR扩增和测序显示含有1.3 Kbp的草鱼呼肠孤病毒VP6基因读码框片段。将目的片段VP6酶切、克隆到携带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的植物表达载体pCAMBIA1302中,再经酶切、PCR扩增和序列测定显示,pCAMBIA1302-VP6含有1.3 Kbp的草鱼呼肠孤病毒VP6基因片段,说明已插入植物表达载体pC...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
冀敏 曾磊 赵凤霞 陈尚武 马会勤
本研究从赤霞珠(Vitis viniferaL.cv.Cabernet Sauvignon)葡萄果实中提取RNA,克隆得到葡萄蔗糖转运蛋白基因VvSUC27;从中蔬6号番茄子叶提取DNA,克隆得到番茄果实特异启动子基因E8。以实验室保存的pCAMBIA 1301为起始载体,分别构建了2个植物表达载体pCE8-SUC27vs和pCE8-SUC27。在这两个载体中,VvSUC27的表达均受番茄果实特异启动子E8的调控,pCE8-SUC27vs含有来自拟南芥葡萄糖转运蛋白基因AtVGT1的细胞液泡膜定位的信号肽编码序列和NOS终止子;pCE8-SUC27包含来自葡萄的蛋白质细胞质膜定位的信号肽编码序...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
尹明安 崔鸿文 樊代明 郭立
以胡萝卜品种 Autumn King的幼苗为材料 ,用 CTAB法提取其基因组 DNA,以 PCR ( Polym eraseChain Reaction)的方法在体外扩增出胡萝卜抗冻蛋白基因 ( afp) ,以 p UCm - T Vector为载体构建成胡萝卜 afp的克隆载体 p TAF,用 Eco R 消化重组质粒 p TAF使其线性化 ,再用 DNA聚合酶 Klenow大片段补平末端 ,然后用Xba 消化 ,获得一末端粘 ,一末端平的目的片段 ( afp)。植物表达载体 p BI12 1用 X ba 和 Sma 双酶切 ,获得一末端粘 ,一末端平的线性质粒。将目的片段与线性质粒在 ...
关键词：
胡萝卜 抗冻蛋白基因 分子生物学
[期刊] 华北农学报
[作者]
毕研丽 沈小燕 丛国正 刘湘涛 常惠芸 才学鹏
为研究口蹄疫病毒RNA聚合酶3D基因的分子生物学特性及定位,构建了3D基因真核表达载体pEGFP-3D,观察了3D在BHK-21细胞中的瞬时表达情况。从重组质粒pMD18-T-3D扩增到3D基因,与pGEM-T easy载体连接,将鉴定为阳性的重组质粒pGEM-3D与表达载体pEGFP-N1分别经BamHⅠ/HindⅢ酶切,进行定向亚克隆;重组表达质粒pEGFP-3D经PCR、酶切鉴定,阳性质粒进行测序。利用脂质体介导阳性pEGFP-3D质粒转染BHK-21细胞,免疫组化检测转染细胞中3D基因表达情况和3D基因在细胞中的定位,Western blotting验证pEGFP-3D融合基因的表达。...
[期刊] 华北农学报
[作者]
王晓晔 石博妹 王英群 李珣 刘徳玉 李铭 李芳芳 胡传活
人工抗凋亡蛋白ＰＴＤ－Ｂｃｌ－ｘ ｌ能保护多种因素引起的细胞异常凋亡，为了获得高纯度Ｂｃｌ－ｘ ｌ与ＰＴＤ（ＰｒｏＴｅｉｎ ＴｒａｎｓＤｕｃＴｉｏｎ Ｄｏｍａｉｎｓ）的融合蛋白，首先采用Ｔｒｉｚｏｌ法提取ｓＤ大鼠肝脏总ｒｎａ，将ｒｎａ反转录为ｃ Ｄｎａ，设计引物以ｃ Ｄｎａ为模板，Ｐｃｒ扩增Ｂｃｌ－ｘ ｌ基因，构建Ｐ ｕｍ１９－Ｔ－Ｂｃｌ－ｘ ｌ质粒，并对质粒双酶切鉴定和测序鉴定；其次设计包含ＰＴＤ序列的Ｂｃｌ－ｘ ｌ引物，以测序正确的Ｐ ｕｍ１９－Ｔ－Ｂｃｌ－ｘ ｌ质粒为模板，Ｐｃｒ扩增ＰＴＤ－Ｂｃｌ－ｘ ｌ序列，将扩增序列克隆入Ｐ ｅＴ２８ａ载体，构建ＰＴＤ－Ｂｃｌ－ｘ ｌ蛋白的原核表达质．．．
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
贾文超 甘鹏 熊亮 潘传英 蓝贤勇 陈宏
【目的】构建pTAT-bSox2-9R融合表达载体,并对其进行原核表达研究,为利用TAT和多聚精氨酸(9R)的跨膜作用实现转录因子蛋白直接重编程牛体细胞提供科学资料。【方法】以GenBank上公布的牛Sox2基因编码区序列为基础,设计并合成含酶切位点、跨膜转导肽TAT和9R的引物;利用PCR扩增方法获得包括Sox2、TAT和9R的重组DNA序列,并将其克隆到空质粒pTAT-HA上,从而构建pTAT-HA-bSox2-9R重组表达载体;将经酶切鉴定和测序验证后的重组表达载体转化大肠杆菌,在不同IPTG浓度和诱导时间等条件下进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析...
[期刊] 华北农学报
[作者]
王聚财 刘运超 陈玉梅 孟凤丽 王爱萍 张二芹 许倩茹 邓瑞广 张改平
利用水稻胚乳细胞生物反应器,构建含有HPV45-L1和HPV58-L1基因的重组植物表达载体,为HPV-45L1和HPV58-L1蛋白的表达提供一种新的高效、低廉的表达方式。利用PCR技术克隆人乳头瘤病毒HPV45-L1和HPV58-L1蛋白编码基因,将其重组于中间载体pMP3和植物表达载体pCAMBIA-1300中,构建含HPV45-L1和HPV58-L1基因的植物表达载体pCAMBIA-1300-pMP3-HPV45-L1、pCAMBIA-1300-pMP3-HPV58-L1,随后采用根癌农杆菌侵染水
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
彭丽桃 李琼 刘合生 陈佩 丰明乾 潘思轶
植物硫化激动素(phytosulfokine-α,PSK-α)是植物体内一种小分子肽类生长调节因子,具有促进细胞增殖等多种生物活性。但由于其在植物体内的含量极低,难以满足PSK-α研究和应用的需要。笔者在前期构建PSK-α原核型表达载体的基础上,研究了影响融合蛋白表达的因素,优化了培养条件,并运用谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)亲和柱层析对融合蛋白进行了分离纯化。通过单因素和正交试验的结果表明:培养温度、诱导剂浓度、诱导剂加入时机和诱导时间均对融合蛋白的表达量和表达形式有很大影响;在诱导温度20℃,扩大培养150 min(菌液培养至OD600值约...
关键词：
植物硫化激动素 表达条件 融合蛋白 纯化
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
张舒婕 邓干臻 龚炎长 俸艳萍 杨庆磊 高俊伟 彭秀丽
构建了鸭MHCⅡα的融合表达载体PET-28a,对融合蛋白在大肠杆菌中表达量的影响因素进行了研究。SDS-PAGE分析表明,诱导温度22℃,时间3 h,IPTG浓度0.05 mmol/L,OD600 nm值0.45,通气量90%和pH 7.2时MHCⅡα融合蛋白的表达量最高,占菌体总蛋白的23.4%,比优化前提高了16.7%。蛋白经纯化后纯度可达90%。Western blot分析表明,该蛋白可被鼠抗鸭MHCⅡα阳性血清识别,具有较好的免疫学活性。
关键词：
鸭 MHCⅡα 融合蛋白 表达条件
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
官丽莉 陈昱 朱栋 韩怡来 崔琪 李海燕 李校堃 姜潮
【目的】获得转金属硫蛋白（ＭＴ）基因的拟南芥植株，为利用植物生物反应器规模化生产ＭＴ奠定基础。【方法】利用融合ＰＣＲ方法，扩增拟南芥ＭＴ基因与油体蛋白ｏｌｅｏｓｉｎ基因的融合基因，将融合基因克隆至表达载体ＰｏＰ上，构建重组质粒ＰｏＰｏｌｅｏｓｉｎＭＴ。采用冻融法将质粒ＰｏＰｏｌｅｏｓｉｎＭＴ转入根癌农杆菌ｅＨＡ１０５中，通过农杆菌介导法转化拟南芥，用ＰＣＲ检测并筛选转基因拟南芥阳性植株，采用ｓＤｓＰＡＧｅ法检测ｏｌｅｏｓｉｎＭＴ融合蛋白的表达，邻苯三酚自氧化法和结晶紫法测定融合蛋白的体外抗氧化活性。【结果】成功构建了植物油体特异表达载体ＰｏＰｏｌｅｏｓｉｎＭＴ，融合蛋白ｏｌｅｏｓｉｎＭＴ在拟南．．．
关键词：
金属硫蛋白 拟南芥 油体蛋白 基因表达
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
官丽莉 陈昱 朱栋 韩怡来 崔琪 李海燕 李校堃 姜潮
【目的】获得转金属硫蛋白（MT）基因的拟南芥植株，为利用植物生物反应器规模化生产MT奠定基础。【方法】利用融合PCR方法，扩增拟南芥MT基因与油体蛋白oleosin基因的融合基因，将融合基因克隆至表达载体pOP上，构建重组质粒pOPoleosinMT。采用冻融法将质粒pOPoleosinMT转入根癌农杆菌EHA105中，通过农杆菌介导法转化拟南芥，用PCR检测并筛选转基因拟南芥阳性植株，采用SDSPAGE法检测oleosinMT融合蛋白的表达，邻苯三酚自氧化法和结晶紫法测定融合蛋白的体外抗氧化活性。【结果】成功构建了植物油体特异表达载体pOPoleosinMT,融合蛋白oleosinMT在拟南...
关键词：
金属硫蛋白 拟南芥 油体蛋白 基因表达
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