采用硫酸铵分级沉淀 ,BlueSepharose 6FastFlow、SPSepharoseFastFlow和HPLC柱层析 ,从河蚬 (Corbiculafluminea)中分离纯化蛋白CFp a。经SDS PAGE测定 ,其分子量为 2 4 .0kD ;经苯酚硫酸法测定 ,其含糖量为 2 .3%。 10～ 16 0 μg/mLCFp a分别处理肝癌细胞BEL74 0 4 72h后 ,采用四氮唑还原法 (MTT)检测癌细胞的生长活性 ,结果显示 ,CFp a对BEL74 0 4癌细胞生长的抑制率在 2 4 .6 %～ 79.2 %。采用质量浓度为 2 0 μg/mL和 4 0 μg/mL的C...

酪蛋白的胃蛋白酶水解物通过RP-HPLC进行分离,并用NG108-15 细胞对其进行阿片样活性鉴定。实验结果表明:酪蛋白经胃蛋白酶处理2 h 后, 其酶解产物中有阿片样活性物质产生, 而酪蛋白本身无阿片活性。

利用超速离心和CsCl梯度离心的方法,从杂色鲍(Haliotis diversicolor Reeve)血淋巴中分离纯化血蓝蛋白(Hcs),SDS-PAGE检测提取的血蓝蛋白由1种亚基构成,分子量为400kD;Native-PAGE电泳检测2个亚基(Isoform)分别为HdH1、HdH2;透射电镜下其四级结构为圆柱体,以多十聚体、二十聚体和少量的十聚体形式存在于血淋巴中。杂色鲍血蓝蛋白在以邻苯二酚为底物的条件下表现出微弱的酚氧化酶活性(Km=25.66mmol/L),胰蛋白酶和SDS能使其酚氧化酶活性增强;以左旋多巴(L-DOPA)为底物则不表现出酚氧化酶活性。

【目的】体外真核表达梅花鹿(Cervus nippon)激活素A重组蛋白并测定其生物活性,为进一步明确激活素A在梅花鹿卵母细胞体外成熟过程中的生理学功能提供基础。【方法】利用RT-PCR技术克隆梅花鹿激活素βA (ActivinβA, ACTBA)亚基基因的cDNA全长序列,同时利用生物信息学对梅花鹿激活素βA的基因特征进行分析。在NCBI数据库下载其他物种激活素βA同源序列,利用Clustalx和MEGA 4软件进行同源比对并构建进化树。构建pcDNA4/ACTBA重组质粒并转染至CHO细胞内,进行目的蛋白的体外表达。采用免疫荧光及Western blot技术对目的蛋白表达情况进行检测,并通过Ni-NTA亲和层析柱对蛋白产物进行纯化。采用Western blot检测了梅花鹿激活素A重组蛋白处理后的猪颗粒细胞中的SMAD2和SMAD3的磷酸化水平。最后采用荧光定量PCR及Western blot检测了梅花鹿激活素A重组蛋白处理后的猪颗粒细胞中类固醇激素合成相关酶的表达量。【结果】克隆得到的梅花鹿ACTBA亚基基因含有1 278 bp的碱基,编码426个氨基酸。同源性比较发现梅花鹿ACTBA基因与牛的ACTBA基因同源性最高达98.4%同源。进化分析表明该基因与同为偶蹄目动物的反刍兽牛和山羊亲缘关系最为接近。经酶切、PCR和测序方法鉴定,成功构建真核表达质粒pcDNA4/ACTBA。免疫荧光显示该质粒在CHO细胞中主要定位在细胞质。Western blot结果显示激活素A的前体蛋白分子量约为58 kD左右。镍亲和层析纯化后的激活素A重组蛋白显著增加SMAD2和SMAD3的磷酸化,表明激活素A可以激活SMAD信号通路。同时成熟的激活素A重组蛋白可以诱导猪颗粒细胞芳香化酶(Aromatase)蛋白表达量上调,类固醇生成急性调节蛋白(steroidogenic acute regulatory protein, StAR)表达量下调,FSH受体基因表达量升高,LH受体基因表达量降低,但胆固醇侧链裂解酶(Cholesterolside-chaincleavageenzyme,CYP11A1orP450scc)及3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-Hydroxysteroid dehydrogenase, 3β-HSD)基因表达量不变。结果表明梅花鹿激活素A重组蛋白可以增强FSH对颗粒细胞的生物学作用,也可以减弱LH对颗粒细胞的生物学作用。【结论】成功构建了激活素A蛋白的真核表达载体,并获得了较高纯度的、具有生物学活性的梅花鹿激活素A重组蛋白,为下一步激活素A蛋白的生物学功能和生理学机制研究奠定了基础。

选用江苏省泰兴市大佛指白果为原料,采用盐溶和盐析的方法,从白果中分离制备出清蛋白(GAP)、球蛋白(GGP)和盐溶蛋白(GSP)。白果蛋白中以清蛋白和球蛋白为主,醇溶蛋白、碱溶蛋白和复合蛋白含量很少。化学成分分析表明,制得的GAP、GGP和GSP中以GAP的蛋白质纯度高,氨基酸组成丰富、合理,属于优质蛋白质。活性试验结果表明GAP的抗氧化活性远高于GGP。

Cry8Ea2蛋白是一种新型苏云金杆菌杀虫晶体蛋白。通过穿梭载体pSXY422b将cry8Ea2导入Bt无晶体突变菌株中,获得工程菌HD8Ea2。Cry8Ea2蛋白在工程菌中获得表达。通过分子筛层析,成功获得纯化的130 kDa活性毒素蛋白。用改进的生物活性测定方法进行Cry8Ea2蛋白对华北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟一龄幼虫的杀虫活性测定,LC50分别为0.267 9μg/mL和0.071 9μg/mL。研究首次发现Cry8Ea2蛋白对华北大黑鳃金龟具有较高毒力,拓展了该蛋白的杀虫谱,为转基因工程提供了新资源。

黄鳝(MonopterusalbusZuiew)肠道经组织捣碎,正丁醇脱脂,硫酸铵分级沉淀,DEAE Sepharose离子交换层析和SephacrylS 200凝胶过滤,得到蛋白酶纯品。经等电聚焦电泳和SDS PAGE均显示为单一条带。酶的等电点为6 2,最适温度为55℃,最适pH值为10 5,Km(酪蛋白)值为5 5×103mg/L。用SDS PAGE和SephacrylS 200测得其分子量分别为26kD和25 5kD。酶的pH稳定性较好,在pH12时室温保持5h,活力还剩55%。NBS、BrAc、TNBS、PMSF对酶有很强的抑制作用,而PCMB、ME对酶活性影响不大。Ca2+对酶活性...

以罗非鱼肠为原料,采用超声波辅助提取技术、电泳技术和层析技术等对罗非鱼肠道蛋白酶进行研究,结果表明:将鱼肠匀浆经超声波提取的粗酶液,用30%～70%的硫酸铵盐进行盐析、HitrapTM Q FF阴离子交换柱纯化及Sephadex G-100凝胶柱分离纯化,得到罗非鱼肠蛋白酶纯品,其比活为335U/mg,得率为32.8%;SDS-PAGE电泳为单一蛋白酶带,分子量为28ku。该酶最适pH为8.0～8.5,在pH7.0～9.0的条件下稳定;最适温度为37～42℃,热稳定性好;该酶的Km值和Vmax值分别为0.605g/L和9.407μg/min。金属离子Ag+、Pb2+对蛋白酶有完全抑制作用,Na...

为寻找抑制杨树叶枯病菌生长的活性成分,进行了绒白乳菇发酵液抑菌活性成分的分离纯化研究。结果表明,发酵液提取物经硅胶柱层析粗分离得到5个组分,其中组分4显现出较高的抑菌活性;组分4经TLC得到样品A和样品B,其中样品B能够完全抑制叶枯病菌生长;薄层检测和GC分析判定样品B为单一化合物,纯度为98.805%;综合UV、IR、EI-MS和NMR的检测结果,推断样品B的分子式是C8H9NO,分子量135,化学名为1-(2-吡啶)-2-丙酮,在绒白乳菇发酵液中首次发现该化合物。

香菇子实体经热水提取，乙醇沉淀，脱蛋白，ＤＥＡＥ纤维素柱及纤维素凝胶柱层析得到淡黄色纤维状疏松固体ＬｅⅢ。ＬｅⅢ经聚丙烯酰胺凝胶电泳和ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ６Ｂ柱层析，证明为分子量分布均一的多糖－蛋白质复合物。ＬｅⅢ红外扫描有典型的多糖吸收峰，气相色谱测单糖组成为阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖，摩尔比为０．３１∶０．４７∶１．００∶１．１５∶８．９２

从山溪鲵(Batrachuperus pachunii)皮肤匀浆液中经过Sephadex G-50凝胶过滤、AKTA(Resource Q阴离子柱和反向高压液相C4柱分离纯化得到相对分子质量为12 000的蛋白。利用其N端氨基酸序列设计引物,从山溪鲵皮肤的cDNA中克隆并筛选到该蛋白的cDNA序列。该cDNA序列的开放阅读框为339 bp,编码113个氨基酸残基组成的蛋白。在BLAST数据库搜寻比对分析表明,该蛋白的氨基酸序列与来自人类及其他哺乳动物β-microseminoprotein蛋白具有约40%的序列同源性。这也是首次在两栖类动物皮肤中确认β-microseminoprotein。初...

采用组织匀浆、饱和硫酸铵分步沉淀和Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析的方法提取和纯化施氏鲟卵黄蛋白,并对其性质进行了研究。结果表明:采用50%和70%饱和度的硫酸铵分步沉淀与Sephadex G-100凝胶层析相结合的方法,可以获得一种卵黄蛋白纯品。Native-PAGE和SDS-PAGE分析表明,该纯化蛋白纯度为100%,由一种同源亚基组成,其亚基的相对分子质量约为30 kD。油红O、免疫印迹(Western-blot)和罗丹明B染色均为阳性,表明该蛋白为施氏鲟卵中的一种脂磷蛋白。

玉米赤霉烯酮是植物体内源产生的一类小分子生理活性物质，已证明它与冬性植物的春化作用密切相关。本研究应用亲和层析和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，对春化的冬小麦幼苗中的玉米赤霉烯酮结合蛋白进行了分离纯化。供试材料为冬小麦品种燕大1817，种子前发后在4℃下春化4周，提取幼苗的水溶性总蛋白进行亲和层析。层析基质为琼脂糖凝胶Sepharose4B，配体为玉米赤霉烯酮多聚赖氨酸复合物。总蛋白溶液先经过Sepharose4B结合后，再与连有配体的亲和胶进行反应，然后洗去非结合蛋白；改变洗脱条件，进一步洗涤得到的为玉米赤霉烯酮结合蛋白（ZBP）溶液。研究结果表明，在春化的冬小麦幼苗中存在两种玉米赤霉烯酮结...

以大菱鲆肠道为材料,对大菱鲆消化生理中起重要作用的肠蛋白酶的分离纯化条件和理化性质进行了研究。经Tris-HCl缓冲液抽提,硫酸铵分级分离,DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephadex G-100凝胶过滤层析分离纯化,获得大菱鲆肠蛋白酶Ⅰ的电泳纯制品,并对该酶的性质进行了研究。结果显示:纯酶的分子量约为58kD。纯酶最适反应pH为9.0,最适反应温度50℃;pH稳定范围6.0~11.0,30℃以下酶活性稳定;Mn2+可激活大菱鲆肠蛋白酶Ⅰ,Cu2+、Zn2+、Ag+、Fe3+则对酶活性有抑制作用;巯基蛋白酶抑制剂显著抑制大菱鲆肠蛋白酶Ⅰ的活性,金属蛋白酶抑制剂...

【目的】构建含有α-胰凝乳蛋白酶作用位点的Cry3A的突变体Cry3Am,以期提高Cry3A的活化效率,增强杀虫活性。【方法】利用重叠PCR技术,构建Cry3A杀虫蛋白的突变体Cry3Am,使之在原核细胞中表达纯化突变体蛋白;将Cry3Am与饲料混合后饲喂黄粉虫,用以评价Cry3Am的杀虫活性。【结果】成功地在Cry3A杀虫蛋白结构域I的α3和α4之间加上1个α-胰凝乳蛋白酶的作用位点,并提取Cry3Am到杀虫蛋白。体外酶切试验结果表明,Cry3Am很容易地被降解为55 kD的杀虫蛋白。生测分析结果表明,Cry3Am对黄粉虫的毒力是Cry3A的2倍以上。【结论】向Cry3A中插入α-胰凝乳蛋白...