为开发噬菌体裂解酶作为一种新型的抗菌剂,用于沙门菌的防控,采用生物信息学及异源表达蛋白的方法,获得鼠伤寒沙门菌噬菌体T139的裂解酶,并验证裂解酶对鼠伤寒沙门菌的裂解活性。通过对鼠伤寒沙门菌噬菌体T139基因组进行分析,发现该基因组全长38 854 bp,平均GC含量为49.10%,不包含tRNA基因。进化树分析表明噬菌体T139属于T7噬菌体属,共预测出43个ORFs,有23个被赋予已知功能。多序列比对及保守结构域分析表明,orf 40基因编码的蛋白(LysT40)包含126个氨基酸残基,具有内肽酶保守结构域,为可能的噬菌体裂解酶。LysT40二级结构中存在大量的螺旋结构(70.63%),使得该蛋白能够保持结构稳定。将orf 40进行异源表达、纯化,经过SDS-PAGE和Western blot分析,在10～15 ku处获得单一目标蛋白条带,纯化的蛋白质量浓度为280μg/mL。LysT40在30 min内对氯仿或EDTA预处理的鼠伤寒沙门菌具有较好的裂解活性,吸光值OD_(600)相比于对照组分别下降0.18和0.31。

【背景】解淀粉欧文氏菌（Erwinia amylovora）是仁果类果树火疫病的病原体，对全球苹果和梨的生产构成严重威胁。随着抗生素耐药菌株的出现，火疫病的防治面临巨大的挑战。【目的】分离一种新的裂解解淀粉欧文氏菌的噬菌体，并分析该噬菌体裂解相关基因的功能，为火疫病的防治提供新的选择。【方法】以解淀粉欧文氏菌Ea102为宿主菌，采用双层平板法从流行火疫病的果园土壤中分离噬菌体。通过噬菌斑和透射电镜观察其形态。用PacBio测序技术测定噬菌体基因组，SPAdes组装序列，RAST注释基因组。通过大肠杆菌原核表达系统分析噬菌体Kuerle的裂解机制。【结果】分离纯化出一株裂解解淀粉欧文氏菌的噬菌体，命名为Kuerle。Kuerle由二十面体衣壳的头部和短尾组成，潜伏期约为50 min，裂解量约为240 pfu/cell。噬菌体基因组全长75 599 bp,GC含量48.0%，末端有393 bp的重复序列，未发现与溶原调控相关的基因。共预测到85个开放阅读框（open reading frame,ORF），其中33个已知功能蛋白中包含一个由3 550 aa组成的巨大病毒颗粒相关的RNA聚合酶（virion-associated RNA polymerase,vRNAP），该vRNAP是Schitoviridae科噬菌体的主要特征之一。病毒粒子和基因结构表明噬菌体Kuerle属于有尾噬菌体类的Schitoviridae科病毒。聚集在DNA晚期表达区的3个裂解相关基因holin、endolysin和spanin组成了“裂解盒”。在大肠杆菌中Kuerle-holin的表达会抑制细胞的生长，而Kuerle-endolysin的表达可裂解细胞。二者共表达时Kuerle-holin会加速Kuerle-endolysin引起的细胞裂解。用叠氮化钠抑制细菌的一般分泌系统（Sec）或Kuerle-endolysin N端信号序列的缺失均会导致endolysin裂解功能丧失。上述结果表明噬菌体Kuerle具有pinholin-SAR endolysin裂解系统。Kuerle-holin(pinholin)使细胞质膜去极化以激活分泌的Kuerle-endolysin(SAR endolysin)降解肽聚糖层。【结论】Kuerle是一株烈性噬菌体并且Kuerle-endolysin抑菌效果显著，为后续火疫病生防试剂的制备提供了理论依据和研究材料。

为研究耐黏菌素大肠杆菌的噬菌体治疗方法，本研究以耐黏菌素大肠杆菌为宿主菌，采用双层琼脂平板法从山东烟台某养鸡场污水样中分离纯化得到裂解性噬菌体SDYTW1-F1-2-2。通过透射电镜观察，最佳感染复数，一步生长曲线，温度稳定性，酸碱度稳定性等生物学特性测定，并对其进行全基因组测序分析。结果表明：1）噬菌体SDYTW1-F1-2-2噬菌斑呈现透亮，外周无晕圈，形态学观察显示其具有可伸缩性尾鞘。2）生物学特性分析表明，噬菌体最佳感染复数为0.1，潜伏期为50 min，爆发期为40 min，爆发量为（331±9）PFU/cell。在温度4～40℃，pH为4～12的环境下，噬菌体活性较为稳定。3）通过噬菌体全基因组测序及核酸类型鉴定显示，该噬菌体基因组全长为74 752 bp，双链DNA,GC含量42.1%。在噬菌体基因组中共鉴定出121个编码蛋白（CDS），包括结构组成、DNA代谢与复制和包装以及细菌裂解相关的功能基因，发现一个tRNA基因，且未检测到如stx-1等致病性基因和mcr-1等耐药基因相关的基因。综上，噬菌体SDYTW1-F1-2-2裂解谱较宽，具有良好的酸碱性、热稳定性以及安全性。本研究为后续开展针对耐黏菌素大肠杆菌的噬菌体治疗研究提供依据。

为了获得广谱噬菌体裂解酶,根据裂解酶结构及种属特异性,将金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶Ply187CHAP及酶K的SH3b重新合成,并同时将末端引入单核细胞增生性李斯特菌噬菌体裂解酶LysZ5结合结构域,构建具有能够裂解金黄色葡萄球菌及李斯特菌的多功能裂解酶。SDS-PAGE结果表明,融合结构域的重构酶蛋白Ply187KS-Z5大小约为58 kDa,其在金黄色葡萄球菌及李斯特菌平板表面能够形成透明裂解圈。分析对金黄色葡萄球菌及李斯特菌在生肉表面的裂解活性表明,嵌合酶蛋白Ply187-KS能够有效裂解金黄色葡萄

为探究单核细胞增生李斯特菌噬菌体裂解酶的特性及在食品基质中的初步应用，从NCBI获取李斯特菌噬菌体裂解酶lys039基因序列，分析其生物信息学，并在大肠杆菌中表达纯化，研究其裂解活性、对生物被膜的影响以及在牛奶基质中的应用。结果表明：1）裂解酶Lys039由341个氨基酸组成，分子质量为36.4 ku，等电点为9.81，其结构具有酰胺酶活性，对本实验室22株单核细胞增生李斯特菌、2株无害李斯特菌、1株伊氏李斯特菌以及1株威氏李斯特菌具有裂解活性，但是对葡萄球菌、枯草芽孢杆菌以及沙门菌没有显示出裂解活性。2）随着Lys039浓度的升高，裂解活性逐渐增强，最适温度为30℃，最适pH值为6.0。3)Lys039能显著清除单核细胞增生李斯特菌形成的生物被膜，并且可以降低牛奶中单核细胞增生李斯特菌的细菌数量。综上，Lys039温度耐受范围广、耐酸耐碱且裂解谱较宽，可显著清除生物被膜以及初步应用效果良好。本研究为进一步防治及快速检测单核细胞增生李斯特菌提供理论基础。

[目的]本文旨在分离一株针对耐多药肠炎沙门菌且宿主谱广泛的烈性噬菌体，并研究其生物学特性。[方法]从山东烟台某鸭场采集58份粪便样品，以鸭源肠炎沙门菌sdc-11为宿主分离噬菌体，并对噬菌体分离株进行形态学观察、温度和pH稳定性、最佳感染复数（MOI）、一步生长曲线测定等生物学特性分析，测试其对73株不同血清型沙门菌的裂解谱，以及对sdc-11生物被膜形成的抑制和对成熟生物被膜的清除作用，最后进行基因组测序分析。[结果] 分离获得1株长尾噬菌体，命名为Salmonella phage YT 90。该噬菌体在30～60℃和pH 4～10的范围内，均表现出较好的增殖能力，最佳感染比是10~(-8)，潜伏期10 min，裂解期80 min，裂解量为278；可裂解76.7%（14/21）肠炎沙门菌、66.67%（28/42）鼠伤寒沙门菌和75%（3/4）鸡白痢沙门菌；在96孔细胞板上，YT90具有抑制sdc-11生物被膜形成的潜力，并能有效清除成熟生物被膜；全基因组测序发现，YT90的基因组全长121 240 bp，不含已知的毒力因子和耐药相关基因，不编码整合酶；基于末端酶大亚基构建的进化树表明，YT90与沙门菌噬菌体GRNsp50关系最近，属于根西病毒亚科（Guernseyvirinae）新泽西病毒属（Jerseyvirus）。[结论]从鸭场粪便样品中分离获得1株烈性噬菌体YT90，可裂解多种血清型沙门菌，耐受性强、潜伏期短、裂解量大，在防治沙门菌感染方面有较好的临床应用潜力。

【目的】分离并纯化出一株裂解性青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)噬菌体,并测定其各项生物学特性,为开发新的抗烟草青枯病制剂提供依据。【方法】取烟草青枯病重病田中健康烟株的根际土壤制成土壤悬浮液,并通过在青枯雷尔氏菌菌液中加入过滤后的土壤悬浮液富集噬菌体,用双层平板法验证噬菌体的存在后挑取单个最大噬菌斑进行反复纯化,直到得到单一清晰的噬菌斑。纯化后的单个噬菌斑加入对数早期的青枯雷尔氏菌菌液中进行增殖培养,将增殖液按常规方法进行噬菌体颗粒浓缩后,取20μL浓缩液用磷钨酸染色并通过电子显微镜观察噬菌体的形态特征;同时将浓缩液进行SDS-PAGE电泳,观察蛋白条带大小和数量;...

【目的】筛选仔猪痢疾病原菌沙门氏菌特异性噬菌体,为噬菌体制剂的研制和仔猪痢疾的生物防治提供参考。【方法】从患痢疾仔猪粪便中分离致病菌沙门氏菌,鉴定后以其为宿主菌,从生活污水中筛选、纯化出特异性噬菌体,并以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为对照,检测该噬菌体的特异性。【结果】分离到了致病菌沙门氏菌,并得到了纯化的沙门氏菌噬菌体;经检测,该噬菌体只能裂解沙门氏菌,而对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌没有作用。【结论】得到了纯化的可裂解沙门氏菌的特异性噬菌体。

为了获得高酶活力的苎麻脱胶果胶裂解酶，为后续分子改造和新型苎麻生物脱胶酶制剂复配提供理论依据。将果胶裂解酶基因pel419从重组质粒pEASY-Blunt E1-pel419更换至pET28a载体中，转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达；用SDS-PAGE和Western Blot检验pel419基因的表达效果；用生物信息学软件分析Pel419理化表征和系统发育，预测其二级结构、高级结构及关键氨基酸位点。结果表明，工程菌pET28a-pel419/BL21的果胶裂解酶活力为434.4 U/mL,较pEASY-Blunt E1-pel419/BL21提高了1.7倍；Pel419含375个氨基酸，N末端前22个氨基酸为信号肽，理论pI值为6.59,有4个半胱氨酸，不稳定系数为18.20;其蛋白结构域含有典型的右手β-螺旋结构，属于Pec lyase C家族；Pel419的Ca~(2+)结合位点为ASP151、ASP153和ASP192,定位发现3个保守位点均暴露在三维空间的表面，并处于底物结合空间口袋。大幅度提高了Pel419表达量，并获得了Pel419关键结构信息。

为探索针对耐药沙门菌的噬菌体治疗方法，以沙门菌SE-21为宿主菌，从污水中分离得到一株烈性噬菌体并命名为vB＿SalP＿QS。在鉴定vB＿SalP＿QS生物学特性的基础上，对vB＿SalP＿QS和vB＿SalP＿SE29混合噬菌体治疗由沙门菌SE-21引起小鼠肠炎的治疗效果进行评价。结果表明：1）电镜观察可见该噬菌体属于有尾病毒目（Caudovirales），其效价为8×10～8 PFU/mL。2)vB＿SalP＿QS的最佳感染复数（MOI）为0.01，潜伏期为40 min，裂解期为50min。温度为4～60℃具有较好的活性，在pH4～pH10范围内非常稳定。平板点滴法试验表明vB＿SalP＿QS可以裂解17株沙门菌，裂解率为44.7%。3）噬菌体vB＿SalP＿QS的全基因组测序分析显示，噬菌体vB＿SalP＿QS全长42 293 bp,GC含量为49%，共含有72个开放阅读框，且不含有溶源性、毒力因子及整合酶基因。4）小鼠体内治疗试验显示，宿主菌SE-21对小鼠最小致死量为5×10～8 CFU/mL，感染小鼠经vB＿SalP＿QS (100μL1×107 PFU/mL)和vB＿SalP＿SE29 (100μL 1×10～7 PFU/mL)混合治疗后存活率为100%，单独用vB＿SalP＿QS治疗组（200μL 1×10～7 PFU/mL）的小鼠存活率为80%，单独用vB＿SalP＿SE29治疗组（200μL 1×10～7 PFU/mL）的小鼠存活率为70%，对照组全部死亡。5）病理组织观察表明，混合噬菌体可以有效杀灭沙门菌SE-21的同时，还能更好地保护小鼠肠绒毛，可显著提高感染SE-21的小鼠存活率。综上，噬菌体vB＿SalP＿QS具有良好的酸碱稳定性、热稳定性以及安全性，混合噬菌体联合治疗效果优于噬菌体单一治疗。本研究为噬菌体制剂治疗沙门菌感染提供了重要依据，也为混合噬菌体鸡尾酒疗法的临床应用奠定基础。

[目的] 本文旨在研究λ噬菌体自阻抑蛋白CI降解对基因表达稳态的影响。[方法] 根据λ噬菌体阻抑物基因cI表达调控的化学反应，建立主方程。应用蒙特卡洛模拟探究cI基因表达稳态结构及其转换。[结果] 随着蛋白质降解速率常数的减小，蛋白质的降解方式由线性降解变为非线性降解，细菌由裂解态经过不稳定的双稳态转换到溶原态。[结论] 阻抑物蛋白CI的降解率及降解方式的变化可能是噬菌体溶原/裂解途径决定的一种新机制。

【目的】禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)是一种严重危害麦类作物的重要植物病原线虫,对农业生产造成巨大的经济损失,然而其致病机制和有效防控方法还有待进一步研究。通过克隆禾谷孢囊线虫的果胶酸裂解酶新基因Ha-pel-1,并对其表达特性进行分析,为后续探究Ha-pel-1的基因功能及其与寄主的互作提供理论依据,并为探讨禾谷孢囊线虫防控途径提供新思路。【方法】采用同源克隆结合RACE技术从禾谷孢囊线虫中克隆出一个新的果胶酸裂解酶基因;采用DNAMAN、Clustal、Signal P 4.0 S

本研究以兽药恩诺沙星为对象,构建噬菌体抗体库,为低成本、快速制备目的抗体提供新的途径。以恩诺沙星-鸡卵清蛋白(ENR-OVA)为免疫原对Balb/c小鼠进行免疫,取其脾细胞提取总RNA,并分别扩增全套抗体轻、重链基因,通过重叠延伸PCR技术,以编码柔性多肽(Gly3Ser)4的基因为接头,将轻重链基因组装为完整的scFv基因,将之克隆入pCANTAB5E载体,转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体M13KO7对其进行超感染,构建噬菌体抗体库并进行富集、筛选和鉴定;构建了库容量约为2.2×106的抗恩诺沙星噬菌体单链抗体库,并筛选出26株阳性克隆,为表达单链抗体、建立免疫检测方法奠定基础。

[目的]通过对诱导耐药沙门菌成簇间隔的短回文重复序列(CRISPR)比对分析,以及cas(CRISPR associated)mRNA表达水平的变化,探讨CRISPR/Cas与沙门菌耐药性的关系。[方法]对鼠伤寒沙门菌ATCC13311进行耐药诱导分别获得3株体外诱导耐药(环丙沙星、庆大霉素、氨苄西林)菌和1株体内诱导耐药(环丙沙星)菌,设计引物对CRISPR,进行PCR扩增并检测,应用CRISPR Finder分析CRISPR序列,对5株沙门菌的CRISPR序列进行比对;利用RT-q PCR检测耐药前后

缢蛏(Sinonovacula constricta)是我国传统的四大海水养殖贝类之一，养殖过程中易受病原菌感染而造成大量死亡和经济损失。Toll样受体(Toll-like receptor， TLR)是目前研究最多的模式识别受体，在无脊椎动物的先天性免疫中发挥着重要作用。研究缢蛏TLR分子特征及其免疫功能对于预防和控制病原菌感染至关重要。本研究从缢蛏基因组序列中鉴定出42个TLR (ScTLR)基因，其中，33个编码典型的TLR蛋白，其余9个为TLR样蛋白。根据蛋白结构域特点，将典型的TLR蛋白分为2大类4个亚类，一类为多半胱氨酸簇TLR (mccTLR)，包括P型TLR (1个)和sPP型TLR (7个)；另一类为单半胱氨酸簇TLR (sccTLR)，包括sP型TLR (16个)和Ls型TLR (9个)。与其他9种软体动物TLR基因的类型和数目比较结果显示，缢蛏基因组中未发现其他软体动物中存在的V型和Twin-TIR型TLR，起源古老的mccTLR类群在软体动物中没有大规模的扩张，而起源较近的sccTLR类群却发生了大规模的扩张。荧光定量PCR分析显示，6种ScTLR在检测的7种组织中普遍表达，且在血细胞、鳃和肝胰腺组织中高表达。最后，副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)胁迫12 h和48 h的缢蛏鳃和肝胰腺转录组数据分析显示，副溶血弧菌感染前后9个TLR基因在鳃或肝胰腺中的表达量发生显著变化，6个基因(ctg118.25、ctg118.26、ctg356.25、ctg774.6、ctg681.6和ctg1513.5)在感染12 h或48 h后的鳃组织中显著差异表达，前5个基因表达量上调，仅ctg1513.5表达量下调；3个基因(ctg467.9、ctg2496.3和ctg903.17)在感染12 h或48 h后的肝胰腺中显著差异表达，其中，ctg467.9和ctg2496.3表达量下调，ctg903.17表达量上调。综上所述，本研究结果将为深入探讨不同TLR基因在缢蛏天然免疫中发挥的作用提供研究基础。