为了解猪源致病性沙门氏菌的耐药状况,建立一种可以快速准确灵敏的确定沙门氏菌耐药表型的检测方法,以满足生产中的实时检测监控及用药指导的需求。所开发的检测方法基于竞争性互补介导核酸恒温扩增(competitive annealing mediated isothermal amplification, CAMP)与微流控芯片于一体的检测技术,分别以β-内酰胺类耐药基因bla_(TEM-1),四环素类耐药基因tetB,氨基糖苷类耐药基因aadA1,这些基因的保守区域片段为靶序列,应用CAMP引物设计推荐规则,设计特异性CAMP引物,通过条件优化建立一种快速检测沙门氏菌耐药基因的方法,并且对该方法的特异性及灵敏度等方面进行了评估。结果表明:所开发的CAMP检测体系可有效检出沙门氏菌,并检测养殖场所实地采集的沙门氏菌不同菌株中bla_(TEM-1)、tetB、aadA1共3种耐药基因,检测结果与测序结果一致,显示出良好的特异性。并且应用本试验建立的CAMP检测方法,沙门氏菌invA基因检测灵敏度最低限为10拷贝,bla_(TEM-1)基因检测灵敏度最低限为102拷贝,aadA1基因检测灵敏度最低限为102拷贝,tetB基因检测灵敏度最低限为103拷贝。本研究所开发的CAMP检测体系,可快速有效地检测沙门氏菌耐药基因,检测体系可使用实时荧光定量PCR设备进行结果判读,也可以使用实验室水浴等温控设备进行基于颜色变化的裸眼结果判读,并可结合微流控芯片进一步提高反应体系密封性,显著减少了试剂用量,降低了对检测设备的需求,从而节约检测成本,将为养殖现场对沙门氏菌耐药状况的实时监测及用药参考提供便捷有力的技术手段。

食源性致病菌污染是食品安全问题的重要隐患之一,沙门氏菌是食品中最常见的食源性致病菌。为快速检测食品中的沙门氏菌,满足食品生产过程中实时检测监控的需要,基于竞争性互补介导核酸恒温扩增(competitive annealing mediated isothermal amplification,CAMP)技术,建立一种操作简便、准确性高、灵敏度高的沙门氏菌快速检测方法。以沙门氏菌invA基因保守区域片段为靶序列,利用DNAMAN设计特异性引物,并在己筛选获得沙门氏菌的CAMP引物基础上,应用CAMP引物设计推荐规则及作用位点,进行加速引物的设计和筛选,评估加速引物对扩增反应的影响;并且对建立的方法进行特异性及灵敏性的检测评估。同时与PCR方法进行比较。结果表明:以沙门氏菌invA基因为目标核酸所设计的一对CAMP引物可以实现对沙门氏菌的快速检测,而且在反应体系中引入加速引物可以将检测时间缩短15min;PCR方法的检测限为103CFU·mL-1,而本研究所建立的方法在65℃恒温条件下80min内检出沙门氏菌,检测限为10CFU·mL-1,检测效率和灵敏度均优于传统PCR方法,而且操作简便,无需精密、复杂的变温仪器;对3株沙门氏菌和10株非沙门氏菌进行特异性检测,3株阳性对照株检测全部为阳性,10株阴性对照菌检测全部为阴性,说明本试验所建立沙门氏菌快速检测方法具有良好的特异性,而且对沙门氏菌无漏检,具有较好的通用性。

为掌握新疆某养殖场羊源沙门氏菌对常用抗菌药物的耐药情况,并了解其携带部分相关耐药基因的流行现状及β-内酰胺酶、16SrRNA甲基化酶和喹诺酮类耐药基因(Plasmid mediated quinolone resistance,PMQR)的共存情况。使用琼脂稀释法对分离的沙门氏菌进行药敏试验,通过PCR方法进行blaTEM、blaCMY-2、blaCTX-M、blaLAP-1、blaKPC、blaOXA、blaSHV等β-内酰胺酶和armA、rmtB等16SrRNA甲基化酶及qnrA、qnrB、qnrC、

为寻求快速简便的检测沙门氏杆菌及其他病原生物新方法,以沙门氏杆菌invA基因为目的片段,设计特异性引物,通过条件优化,建立了检测沙门氏杆菌的HDA法,用4株沙门氏杆菌和6种其他病原菌(大肠埃希菌、志贺氏菌、变形杆菌、绿脓杆菌、葡萄球菌、链球菌)考核特异性,用稀释法测定灵敏度.结果表明,本研究建立的HDA法可在恒温水浴锅中进行,扩增时程75 min;阳性检测率为100%,无假阳性;用HAD法检测12份饲料样品,结果检出沙门氏杆菌呈阳性的3份,阳性率为25%.HDA法极适合基层实验室使用.

为了解新疆乌鲁木齐市宠物源沙门氏菌耐药及耐药基因携带情况,对分离的39株宠物源沙门氏菌采用琼脂稀释法进行药敏试验,PCR方法进行PMQR因子、β-内酰胺酶基因、氨基糖苷类基因、四环素类基因、酰胺醇类基因及多肽类基因检测。结果表明:乌鲁木齐市宠物源沙门氏菌对环丙沙星和阿莫西林的耐药率均高达97.4%(38/39),对诺氟沙星、恩诺沙星、氨苄西林、卡那霉素、四环素和氟苯尼考的耐药率均高达100%(39/39),对头孢噻呋、安普霉素、阿米卡星和庆大霉素100%敏感;耐药菌株以8耐为主,其主要耐药谱型为CIP-NOF-ENR-AMLAMP-KANA-TE-FFC;主要检出的β-内酰胺酶基因有blaTEM和blaOXA;主要检出的PMQR因子有qnrS、oqxA、oqxB和aac(6′)-Ib-cr;主要检出的氨基糖苷类基因有aadA2和ant(3″)-Ia;主要检出的四环素类基因有tetB;主要检出的酰胺醇类基因有floR。耐药基因以blaTEM+blaOXA+qnrS+oqxA+oqxB+aac(6′)-Ib-cr+aadA2+ant(3″)-Ia+tetB+floR共存类型为主。因此临床治疗宠物疾病时应尽量少用人用药物特别是人用新药,多使用兽用敏感药物,避免人发病时无药可用事件的发生。

为探明新疆焉耆地区4种动物(牛、鸡、猪、羊)源沙门菌对临床常用抗菌药物的耐药性及其携带耐药基因的情况,通过选择性培养基和管家基因invA的PCR检测,分离、鉴定沙门菌;采用琼脂稀释法检测其对11种抗菌药物的最小抑菌浓度;在分离株中用PCR的方法检测14种耐药基因。结果表明:共分离出不同动物源沙门菌191株,分离率从高到低依次为牛源(62.0%)、鸡源(28.3%)、猪源(9.0%)和羊源(8.5%);不同动物源沙门菌对被检抗菌药物显示出不同程度的耐药性,鸡源、羊源、猪源、牛源的耐药严重程度依次降低,鸡源沙门菌耐药谱宽,多药耐药在0～3、5～7耐有分布,对四环素和氟苯尼考耐药率在70.0%以上,羊源沙门菌对氨苄西林的耐药率(88.2%)高于其他动物源的,多药耐药以7耐(23.5%)为主,牛源沙门菌对环丙沙星的耐药率(66.1%)高于其他动物源的,多药耐药以4耐(38.7%)为主,不同动物源沙门菌均对磷霉素、亚胺培南和多粘菌素敏感,耐药谱型多样化;不同动物源沙门菌中除qnr S和mcr–1基因未检出外,其余被检耐药基因均有检出,blaCMY–2和tetA基因仅在猪源沙门菌中被检出,不同动物源沙门菌均以同时携带blaTEM、blaOXA、tetB、oqxA、oqxB、aadA2、ant(3")–Ia、aac(6')–Ib–cr、floR耐药基因为主,牛源沙门菌对以上耐药基因检出率最高,在35%以上,羊源与猪源沙门菌对以上耐药基因检出率在20%左右,鸡源沙门菌对以上耐药基因检出率不到10%。

为探明新疆焉耆地区4种动物(牛、鸡、猪、羊)源沙门菌对临床常用抗菌药物的耐药性及其携带耐药基因的情况,通过选择性培养基和管家基因invA的PCR检测,分离、鉴定沙门菌;采用琼脂稀释法检测其对11种抗菌药物的最小抑菌浓度;在分离株中用PCR的方法检测14种耐药基因。结果表明:共分离出不同动物源沙门菌191株,分离率从高到低依次为牛源(62.0%)、鸡源(28.3%)、猪源(9.0%)和羊源(8.5%);不同动物源沙门菌对被检抗菌药物显示出不同程度的耐药性,鸡源、羊源、猪源、牛源的耐药严重程度依次降低,鸡源沙门菌耐药谱宽,多药耐药在0～3、5～7耐有分布,对四环素和氟苯尼考耐药率在70.0%以上,羊源沙门菌对氨苄西林的耐药率(88.2%)高于其他动物源的,多药耐药以7耐(23.5%)为主,牛源沙门菌对环丙沙星的耐药率(66.1%)高于其他动物源的,多药耐药以4耐(38.7%)为主,不同动物源沙门菌均对磷霉素、亚胺培南和多粘菌素敏感,耐药谱型多样化;不同动物源沙门菌中除qnr S和mcr–1基因未检出外,其余被检耐药基因均有检出,blaCMY–2和tetA基因仅在猪源沙门菌中被检出,不同动物源沙门菌均以同时携带blaTEM、blaOXA、tetB、oqxA、oqxB、aadA2、ant(3")–Ia、aac(6')–Ib–cr、floR耐药基因为主,牛源沙门菌对以上耐药基因检出率最高,在35%以上,羊源与猪源沙门菌对以上耐药基因检出率在20%左右,鸡源沙门菌对以上耐药基因检出率不到10%。

[目的]通过对诱导耐药沙门菌成簇间隔的短回文重复序列(CRISPR)比对分析,以及cas(CRISPR associated)mRNA表达水平的变化,探讨CRISPR/Cas与沙门菌耐药性的关系。[方法]对鼠伤寒沙门菌ATCC13311进行耐药诱导分别获得3株体外诱导耐药(环丙沙星、庆大霉素、氨苄西林)菌和1株体内诱导耐药(环丙沙星)菌,设计引物对CRISPR,进行PCR扩增并检测,应用CRISPR Finder分析CRISPR序列,对5株沙门菌的CRISPR序列进行比对;利用RT-q PCR检测耐药前后

【目的】研制一种能有效指示假阴性的PCR检测产品,用于沙门氏菌快速、准确、灵敏的检测。【方法】针对沙门氏菌invA基因、stn基因序列分别设计引物与扩增内标,建立添加扩增内标的沙门氏菌PCR检测方法,组装试剂盒,并对试剂盒的各项性能进行评价。【结果】试剂盒对147株沙门氏菌和28株非沙门氏菌的检测结果显示,所有沙门氏菌均能扩增出362 bp的目标条带,非沙门氏菌仅扩增出520 bp的内标条带。试剂盒检测沙门氏菌基因组DNA的检测限为8.0 fg/PCR,检测染菌量为4—5 CFU/10 mL的牛奶样品,增菌8—10 h即得到阳性结果。反复冻融60次或-20℃下贮存1年,均不影响试剂盒的使用效果...

沙门氏菌是人畜共患的重要食源性病原菌,建立灵敏的双重PCR方法有益于实现对致病性沙门氏菌(Sal-monella)的快速检测。以沙门氏菌毒力岛基因为研究对象,根据GenBank发表的沙门氏菌毒力岛基因序列,分别设计合成了沙门氏菌毒力岛mgtC和sopB的2对引物。以鼠伤寒沙门氏菌(ATCC9150)菌株的核酸为模板,经过引物特异性试验,DNA模板灵敏度试验,优化反应条件,成功地建立了快速鉴别以及检测鼠伤寒沙门氏菌的双重PCR方法。特异性试验结果表明,引物mgtC和sopB建立的双重PCR仅能扩增出沙门氏菌(ATCC9150)的2段特异性片段,大小分别是500,1 000 bp。敏感性试验结果表...

本文参照GB/T13091-2002和GB4789.4-2010方法对1份骨粉样品进行沙门氏菌检测。结果表明:25 g样品中检出沙门氏菌,经血清分型确认为利卡沙门氏菌,该沙门氏菌血清型在四川省属首次检出。同时对样品受污染原因进行了研究,旨在为避免骨粉类产品受沙门氏菌污染提供意见与参考。

【目的】空肠弯曲菌是一种重要的人畜共患病致病菌,主要经被污染的水源、乳制品、生禽肉进行传播,建立快速、准确的诊断方法是防控空肠弯曲菌感染的重要措施。【方法】本文引入一种新型的核酸检测技术——DNA环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),以空肠弯曲菌ORF-C序列为检测靶基因,建立了空肠弯曲菌LAMP快速检测方法。【结果】利用本LAMP方法对21种病原菌进行检测,仅空肠弯曲菌为阳性结果,说明该方法具有高度的特异性。该LAMP方法对空肠弯曲菌纯培养菌的检测灵敏度达6CFU/反应管,对污染材料中空肠弯曲菌的检测灵敏度为9CFU/反应管...

【目的】通过筛选引起马流产的4种沙门氏菌（Salmonella）共同的优势抗原，建立一种敏感高、特异强的通用型间接ELISA(iELISA)抗体检测方法，实现对马群中沙门氏菌抗体的快速高通量检测。【方法】首先利用马流产沙门氏菌阳性血清、阴性血清分别与马流产沙门氏菌全菌抗原进行免疫共沉淀（pull down）试验，筛选出马流产沙门氏菌优势抗原；根据质谱分析结果找到优势抗原基因，将优势抗原基因与其他3种致马流产沙门氏菌病的鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌进行序列比对验证其保守性；其次根据抗原性分析对优势抗原编码基因进行分段表达，设计3对引物，利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增沙门氏菌优势抗原基因并将其分别克隆至原核表达载体pET28a；测序分析后将构建正确的重组质粒分别转化入大肠杆菌(Escherichia coli E.coli)Rosetta(DE3)中并加入0.6 mmol·L~(-1)异丙基-β-D-硫代半乳糖甘(Isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG）进行诱导表达，观察蛋白的表达形式；蛋白纯化后通过Western blot验证蛋白的反应原性和广谱性；然后利用纯化后蛋白作为包被抗原，通过对包被抗原量、血清和第二抗体浓度等条件进行优化建立马流产沙门氏菌病间接ELISA抗体诊断方法，并对该方法的特异性、敏感性进行评估。最后将该方法应用于试验感染马血清及临床样本的检测，并将检测结果同凝集试验结果比较。【结果】筛选出的马流产沙门氏菌优势抗原是ompA(Outer Membrane Protein, OMP)，通过序列比对，该蛋白氨基酸序列与同属鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌同源性99.4%—100%，具有很好的保守性；PCR扩增后成功获得3条与预期符合的目的基因；成功构建了pET28a-ompA1、pET28a-ompA2、pET28a-ompA33个重组质粒。SDS-PAGE结果表明，在24℃、0.6 mmol·L~(-1) IPTG诱导5 h下，含有pET28a-ompA1、pET28a-ompA2、pET28a-ompA3的重组菌均表达了相应蛋白，其中重组ompA1和ompA2蛋白以包涵体形式表达，重组ompA3蛋白以可溶性形式表达；Western blot显示，重组蛋白ompA3可与马流产沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌阳性血清发生特异性反应，证明重组ompA3蛋白具有良好的反应原性，可以作为沙门氏菌属抗血清检测用抗原；以ompA3蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA方法，在最大P/N比确定的最佳反应条件如下：最佳包被抗原浓度为1μg·mL~(-1)，待检血清（1﹕200）37℃作用1 h，酶标抗马二抗（1﹕10 000稀释），TMB在37℃孵育10 min，待检血清OD450>0.143判定为阳性，特异性试验结果显示，该包被抗原与常见马传染病阳性血清无交叉反应。通过对沙门氏菌静脉注射感染马的血清样品进行抗体检测，iELISA可以持续监测抗体阳性到116 d，相比微量凝集（69 d）多监测了47 d，因此iELISA具有更好的敏感性。利用建立的iELISA方法对8个不同牧场180份血清进行抗体检测，其抗体平均阳性检出率为63.3%，比微量凝集阳性检出率高53.9%。【结论】成功筛选到了马流产沙门氏菌病4种病原的共同优势抗原ompA，实现了对该蛋白的可溶性表达，建立了马流产沙门氏菌病通用型iELISA抗体诊断方法，该方法可以实现对临床样本马流产沙门氏菌抗体的检测，该方法具有特异性强、敏感性高，可以作为马流产沙门菌病抗体检测的一种有效工具。

为研究奥斯陆莫拉菌的致病机制及防控措施,对疑似患有奥斯陆莫拉菌的病猪肺组织进行病原分离,得到了1株优势菌命名为ZF2。对分离菌株进行形态学观察、生化试验、分子生物学鉴定,动物回归试验和药敏试验。结果显示,分离菌株为革兰阴性杆菌且对健康仔猪具有较强的致病性,经生化试验和分子生物学分析鉴定为奥斯陆莫拉菌。该分离菌株对阿奇霉素、红霉素呈现较强的耐药性。经大环内酯耐药基因检测结果显示erm B基因为阳性。本研究对奥斯陆莫拉菌病选择合理、正确的抗菌药物提供了一定的科学依据,并为进一步研究其耐药机制奠定了基础。

【目的】金黄色葡萄球菌是一种人畜共患病的重要致病菌,主要经食品传播,引起食物中毒、组织及器官的化脓性炎症,建立快速、准确的检测方法对预防和控制金黄色葡萄球菌的传染具有重要意义。【方法】DNA环介导恒温扩增(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是一种新颖的快速、高灵敏核酸扩增技术,本研究利用该技术建立金黄色葡萄球菌LAMP检测方法。基于金黄色葡萄球菌高度保守的Sa442基因序列,设计4条特异性LAMP扩增引物,两条外引物F3和B3及两条内引物FIP和BIP,在BstDNAPolymerase作用下,65℃恒温水浴中,对26个种类共45株细菌进行扩增...