【目的】沙棘是水土保持和防沙治沙的重要木本油料树种，种子油富含生物活性成分，种子含油率低是制约沙棘开发和利用的主要瓶颈。本研究通过克隆沙棘种子油脂合成关键基因GPD1(glycerol-3-phosphate dehydrogenase)、DGAT1(diacylglycerol acyltransferase 1)和DGAT2(diacylglycerol acyltransferase 2)，并进行了拟南芥异源过表达，以期为高油沙棘培育提供科学依据。【方法】基于沙棘转录组测序结果，以沙棘种子c DNA为模板克隆HrGPD1、HrDGAT1和HrDGAT2基因，通过In-fusion连接技术构建pCAMBIA1300-mCherry表达载体，通过农杆菌介导法将表达载体转入农杆菌GV3101，采用农杆菌蘸花法获取过表达油脂合成关键基因的拟南芥植株。利用实时荧光定量qRT-PCR分析HrGPD1、HrDGAT1和HrDGAT2在转基因拟南芥中的表达情况，利用氯仿甲醇法对T2代转基因和野生型的拟南芥进行含油率检测。【结果】通过PCR技术扩增得到了正确的HrGPD1、HrDGAT1和HrDGAT2基因序列，HrGPD1全长975 bp，编码氨基酸324个，分子量为35.55 kDa，等电点为5.36;HrDGAT1全长1 608 bp，编码氨基酸535个，分子量为61.24 kDa，等电点为8.84;HrDGAT2全长993 bp，编码氨基酸330个，分子量为37.21 kDa，等电点为9.72。GPD1蛋白序列中含有1个保守结构域，属于甘油-3-磷酸脱氢酶家族成员，与枣和桑树亲缘关系较近；DGAT1、DGAT2蛋白序列中各含有1个保守结构域，属于膜结合O-酰基转移酶家族成员，DGAT1与枣亲缘关系较近，DGAT2与苹果和梨亲缘关系较近。通过农杆菌转化技术得到了稳定过表达HrGPD1、HrDGAT1和HrDGAT2的拟南芥株系。与野生型相比，过表达HrGPD1、HrDGAT1和HrDGAT2基因拟南芥T2代种子的含油率分别提高了5.09%、4.73%和2.51%。【结论】克隆获得沙棘HrGPD1、HrDGAT1和HrDGAT2的全长cDNA序列并鉴定功能，发现HrGPD1、HrDGAT1和HrDGAT2可以提高转基因拟南芥的种子含油率，为沙棘高油品种的培育提供了基因材料，对沙棘种子产油量提升具有重要意义。

[目的]探讨沙棘果肉油脂合成积累与源汇基因表达的关系。[方法]以8个不同发育时期的近缘高油品系‘TF2-36’和低油品系‘杂56’果肉为材料,利用氯仿甲醇法测定含油率,采用qRT-PCR技术分析油脂合成源基因(GPD1)和汇基因(DGAT1和DGAT2)在近缘高低油果肉间的表达差异及其对油脂合成积累的影响。[结果]研究表明:(1)沙棘果肉含油率呈先上升后稳定趋势,‘TF2-36’的果肉含油率一直高于‘杂56’;(2)GPD1、DGAT1和DGAT2基因在‘TF2-36’果肉发育期间中均有明显高于‘杂56’

高温是制约坛紫菜(Neoporphyra haitanensis)产业发展的主要因素之一，阐明坛紫菜高温胁迫应答机理对耐高温品种选育至关重要。人们已分离多个坛紫菜抗逆相关基因，但尚不清楚这些基因的表达调控机制。本研究通过分子生物学和生物信息学技术分离了坛紫菜转录因子NhbZIP1基因。该基因开放阅读框长825 bp，编码274个氨基酸。从开放阅读框推导的氨基酸序列有5个低复杂度区域和1个BRLZ结构。其中，BRLZ是bZIP家族的保守结构域，含有一个α卷曲螺旋结构(121～171 aa)。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测发现，NhbZIP1受高温胁迫显著诱导。为进一步阐明NhbZIP1的功能，将其转入莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中。结果显示，高温胁迫下转基因藻株生物量始终高于野生型，且随处理时间增加差异越来越显著。转基因藻株中热激蛋白家族和抗氧化系统相关基因的表达量显著高于野生型。研究表明，NhbZIP1激活下游抗逆基因表达，在坛紫菜应答高温胁迫中发挥重要作用。研究结果有助于阐明bZIP调控坛紫菜响应高温胁迫的分子机制，为耐高温新品种选育提供了基础信息。

高温是制约坛紫菜(Neoporphyra haitanensis)产业发展的主要因素之一，阐明坛紫菜高温胁迫应答机理对耐高温品种选育至关重要。人们已分离多个坛紫菜抗逆相关基因，但尚不清楚这些基因的表达调控机制。本研究通过分子生物学和生物信息学技术分离了坛紫菜转录因子NhbZIP1基因。该基因开放阅读框长825 bp，编码274个氨基酸。从开放阅读框推导的氨基酸序列有5个低复杂度区域和1个BRLZ结构。其中，BRLZ是bZIP家族的保守结构域，含有一个α卷曲螺旋结构(121～171 aa)。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测发现，NhbZIP1受高温胁迫显著诱导。为进一步阐明NhbZIP1的功能，将其转入莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中。结果显示，高温胁迫下转基因藻株生物量始终高于野生型，且随处理时间增加差异越来越显著。转基因藻株中热激蛋白家族和抗氧化系统相关基因的表达量显著高于野生型。研究表明，NhbZIP1激活下游抗逆基因表达，在坛紫菜应答高温胁迫中发挥重要作用。研究结果有助于阐明bZIP调控坛紫菜响应高温胁迫的分子机制，为耐高温新品种选育提供了基础信息。

【目的】对芝麻△9硬脂酰-ACP脱饱和酶基因SiSAD(△9 stearoyl acyl-carrier-protein desaturase)进行克隆与表达分析,并转入拟南芥,探究其在油酸合成过程中的作用,为芝麻油酸含量的遗传改良提供分子基础。【方法】提取中芝13叶片的总RNA,反转录为cDNA。根据芝麻基因组数据库中的SiSAD序列信息(序列号为SIN_1008977)设计引物,以cDNA为模板,通过RT-PCR克隆获得SiSAD编码区序列,并与参考基因组序列进行比较。利用InterPro进行保守结构域分析,获得SiSAD蛋白的保守结构域。利用BLAST对SiSAD蛋白进行同源对比,获得SiSAD的同源蛋白质。采用邻接法构建系统进化树,获得芝麻SAD蛋白与橄榄、牵牛花、蓖麻、莴苣、葡萄、柑橘、拟南芥等植物SAD蛋白的亲缘关系。通过荧光定量PCR检测SiSAD在2个芝麻品种中芝33和中丰芝一号的根、茎、叶、蕾和种子中的相对表达量,分析SiSAD的表达特异性。将SiSAD连接过表达载体,通过农杆菌介导法转化野生型拟南芥(Col-0),筛选阳性后代,对T3代转基因和野生型的拟南芥种子中硬脂酸和油酸相对含量进行测定,分析SiSAD的功能。【结果】成功获得SiSAD的编码区序列,与参考基因组序列一致,全长为1 152 bp,编码383个氨基酸,SiSAD蛋白的分子量为43 kD,等电点为6.18。发现SiSAD蛋白含有一个保守结构域,属于脂肪酸去饱和酶家族成员,与其他植物的SAD蛋白质序列的同源性较高,暗示SiSAD在不同物种中的功能可能比较保守。系统进化分析显示,芝麻SAD蛋白与牵牛花和橄榄的SAD蛋白处于同一分支,进化关系较近,与蓖麻、拟南芥、柑橘的SAD蛋白亲缘关系较远。荧光定量PCR结果表明,SiSAD在芝麻种子中的表达量远远高于其他组织,有显著的组织特异性。成功构建了SiSAD的过表达载体,通过农杆菌介导法转化拟南芥,结果表明SiSAD成功导入拟南芥中,而且转录水平很高。对T3代转基因拟南芥种子中硬脂酸和油酸的相对含量分析表明,与野生型拟南芥比较,3个转SiSAD拟南芥株系中硬脂酸(C18:0)含量分别降低了3.0%、4.8%和6.1%,而油酸(C18:1)含量分别升高了2.8%、4.3%和7.8%,平均升高4.97%。【结论】克隆获得芝麻SiSAD的全长cDNA序列,鉴定了SiSAD的功能,发现SiSAD在油酸合成代谢过程中正向增加油酸含量,可应用于高油酸芝麻新品种培育。

DGAT酶是催化TAG合成途径即Kennedy途径中唯一的限速酶。根据已报道油茶DGAT1基因部分cDNA序列设计引物,利用RT-PCR和RACE技术,对油茶DGAT1基因进行克隆及序列分析。结果表明:该基因序列全长为2 046 bp,包含1个完整的1 548 bp ORF及269 bp 5’UTR和229 bp 3’UTR,编码515个氨基酸;该基因被命名为co-dagt1。经过比对分析,发现油茶的DGAT1基因具有DGAT1基因特有的保守序列和相关特征,而且与其他植物的DGAT1基因具有较高的相似性,并对其蛋白质序列和理化性质进行了分析。

生氰糖苷是由氰醇衍生物的羟基和D-葡萄糖缩合形成的糖苷,已在2 000多种植物中发现,分属于蕨类植物、裸子植物和被子植物的130个家族。生氰糖苷的主要生物学功能在于阻止食草动物和病原体对植物的侵害。通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术从小佛肚竹Bambusa ventricosa幼笋中克隆到CYP79家族同源基因的cDNA全长,命名为BvCYP79。BvCYP79共有1 913个碱基对,翻译起始点为193碱基处,终止子位于1 752 bp,包含1个1 559 bp的完整编码区,开放阅读框共编码519个氨基酸。具有PERF和SFSTGRRGCIA保守结...

木本克隆植物中国沙棘能够通过克隆生长调节来适应土壤水分有效性或土壤水分异质性,这种调节最终影响其种群数量和结构特征。为了验证这一假设,根据野外调查数据分析了中国沙棘种群数量和结构等对土壤水分有效性的可塑性响应。结果表明,随着土壤水分有效性的提高,中国沙棘克隆种群生物量及个体生长量增大,种群发育进程和个体大小分化加速,而克隆子株密度以及种群增长率呈现先增加后减小的趋势;增长型年龄结构的种群可形成合理的等级结构,其不同高度级的个体数量分布符合直线模型。据此,木本植物克隆可塑性变化最终必然导致种群数和结构改变的假设得以验证。

【目的】分离和克隆苎麻果胶合成关键酶GalAT基因部分序列,了解其在不同组织部位的表达情况。【方法】采用简并引物RT-PCR法克隆基因,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定氨基酸序列进行分析,并用荧光实时定量PCR法研究GalAT基因在不同组织中的表达。【结果】克隆了986bp的GalAT基因部分序列(GenBank注册号:EU131377),可编码328个连续的氨基酸序列;核苷酸序列和推定的氨基酸序列与拟南芥的Galacturonosyltransferase4同源性最高,分别为77%和83%;推定的氨基酸序列与拟南芥的Galacturonosyltransferase4可聚为一类;G...

【目的】鉴定调控黄瓜果实中L-半乳糖途径维生素C(Vc)合成相关基因的位置、数量及表达特征，同时对关键基因进行克隆分析，旨在为黄瓜果实中Vc合成调控研究奠定基础。【方法】根据已报道的拟南芥中L-半乳糖途径合成Vc相关基因，利用蛋白编码的氨基酸序列在黄瓜9930＿V2参考基因组数据库中进行BLAST比对，确定黄瓜中的同源基因，借助TBtools软件绘制基因在染色体上的位置。通过q RT-PCR分析上述基因在果实Vc含量差异显著的两份黄瓜材料中的表达量。利用PCR扩增对限速酶GDP-L-半乳糖磷酸化酶（GGP）及GDP-甘露糖-3′5′-差向酶（GME）同源基因进行克隆，测序分析这些基因在高Vc含量与低Vc含量黄瓜果实中的序列差异。构建系统进化树，分析黄瓜果实GME、GGP与其他物种中同源基因的亲缘关系。【结果】在黄瓜基因组中比对到21个参与L-半乳糖途径合成Vc相关酶PMI、PMM、GMPase、GME、GGP、GPP、Gal DH、Gal LDH的同源基因，7条染色体均有分布，在5号染色体和1号染色体上分布最多。通过对21个基因在两份果实Vc含量高低差异显著的两份材料CG45（高Vc含量）和R48（低Vc含量）的表达量分析，发现调控PMI、PMM、GMPase、GME、Gal LDH这5个酶的基因在CG45和R48中有极显著的表达差异。对Vc合成限速酶GGP和GME相关基因在CG45和R48两份材料中进行克隆发现，Cs GME2在R48中基因全长为3 537 bp，在CG45中基因全长为3 541 bp，该基因在两份材料存在多个SNP位点差异和Indel差异，有一个突变位点位于CDS区，且导致了氨基酸序列的改变。通过对调控Vc合成限速酶GME、GGP蛋白性质分析，发现限速酶GME、GGP在不同物种的蛋白性质差异不大，均为亲水性蛋白，功能相对保守。进化树分析发现不同物种亲缘关系较近的聚类在一起，进化过程高度保守。【结论】鉴定出21个分布于7条染色体上的黄瓜果实Vc合成的L-半乳糖途径相关基因，推测关键酶PMI、PMM、GMPase、GME、Gal LDH、GGP可能影响黄瓜果实中Vc含量变化，调控Vc合成限速步骤关键酶GME、GGP功能相对保守，Vc合成限速步骤关键酶GME基因Cs GME2在高Vc和低Vc两份材料中的一个SNP位点变异导致氨基酸序列的变化。

由堀氏菊柄锈菌(Puccinia horiana Henn.)引起的菊花白色锈病,对菊花的栽培产业造成了严重的经济损失。抗病品种培育是解决白色锈病对菊花产业造成巨大危害的重要尝试,通过分析CmWRKY15-1启动子的活性和功能,为抗病基因的发掘和抗病品种改良提供参考。利用HiTAIL-PCR技术,从菊花C029中克隆CmWRKY15-1的启动子序列,将获得的启动子序列通过PlantCARE和PLACE软件进行顺式作用元件分析。为进一步探究启动子的功能,构建CmWRKY15-1启动子控制GUS基因植物表达载体,用农杆菌介导法转化菊花C029,对转基因阳性植株进行GUS组织化学染色,验证CmWRKY15-1启动子的活性。并通过酵母单杂交技术探究NPR1与CmWRKY15-1启动子之间的调控关系。结果表明:克隆出1485bp的CmWRKY15-1启动子序列,软件分析表明其含有病原菌诱导元件W-box和GT1-motif、防御应激元件TC-rich repeats、SA诱导元件As1/ocs等。GUS组织化学染色结果显示,当堀氏菊柄锈菌诱导48h时,叶片上的蓝色面积最大且颜色深,说明CmWRKY15-1启动子具有很强的病原菌诱导活性。此外,通过酵母单杂交技术证明了NPR1可以结合CmWRKY15-1启动子序列,参与防御菊花白色锈病的过程。

为进一步挖掘小麦春化相关基因,探明小麦春化发育调控机制,从不同春化发育特性小麦品种春化响应转录组高通量测序结果中筛选并克隆到1个EST序列,命名为Trx59,该基因的开放阅读框为372 bp,编码124个氨基酸,保守结构域分析显示,Trx59基因有1个Thioredoxin结构域。利用qRT-PCR分析了在春化处理过程中Trx59基因在不同春化发育特性小麦品种的表达特性,并利用VIGS技术进行基因功能的初步验证。结果表明:随着春化处理时间的延长,Trx59基因的表达量逐渐升高,从表达量和表达时间来看,Tr

长叶红砂(Reaumuria trigyna)是一种珍稀泌盐盐生植物,其特有的盐腺结构是长叶红砂适应盐渍荒漠环境的关键,膜泡运输参与该植物的盐腺分泌过程。本研究基于盐胁迫下长叶红砂的转录组数据,克隆获得膜泡运输相关基因RtVAMP2-2。生物信息学分析发现,RtVAMP2-2基因的开放阅读框为1 074 bp,编码357个氨基酸;亚细胞定位和表达特性分析表明,该基因定位于细胞质膜,其表达受盐胁迫诱导;构建植物表达载体,将RtVAMP2-2基因转入拟南芥(Arabidopsis thaliana)中进行功能鉴定,结果显示,转基因拟南芥呈现盐敏感的表型,推测RtVAMP2-2基因可能在植物耐盐中发挥负调控作用。

【目的】探讨中国沙棘克隆生长对造林密度的早期响应及其生物量分配调节机制,确定利于种群稳定性长期维持的适宜造林密度。【方法】设置4个造林密度,即2 500、4 444、10 000、40 000株·hm(-2)。调查测定时,分株生长能力采用每木检尺法,克隆繁殖能力采用子株个体计数法,克隆扩散能力采用跟踪挖掘法,地上生物量采用平均标准木法,垂直根生物量测定采用格子样方法和全挖法,水平根生物量测定采用跟踪挖掘法。【结果】随着造林密度的增大,分株地径和冠幅生长量呈对数函数下降,而树高生长量差异不显著;克隆繁殖、克

以美洲黑杨Populus deltoides新萌叶片为材料,通过自行设计引物,用RT—PCR的方法克隆了美洲黑杨木质素合成关键基因4CL和CAD基因部分序列。测序结果表明:这两个基因片段长度分别为859 bp和493 bp。此外,人工合成了4CL基因木质部特异表达启动子4CLp,长度为1 180 bp。分别用限制性内切酶Hind III/BamH I、BamHI/Sma I和Sma I/Sac I对4CLp、4CL和CAD基因序列进行双酶切,同时用Hind III/Sac I对pBI121表达载体进行双酶切,回收了目的片段。酶切回收后用T4DNA连接酶克隆到植物表达载体pBI121中,并转化至...