为建立永生化山羊子宫内膜上皮细胞系并研究其生物学特性,将人端粒酶逆转录酶催化亚单位(Human telomerase reverse transcrip tase,hTERT)导入原代培养的山羊子宫内膜上皮细胞(Endometrium epithelial cells,EECs),经G418筛选培养,以获得一株永生化山羊子宫内膜上皮细胞(hTERT-EECs);利用流式细胞仪检测其生长周期、凋亡情况及倍体情况;利用MTT法检测其血清依赖性;软琼脂克隆形成试验检测其在半固体培养基中的克隆形成能力;裸鼠致瘤实

【目的】优化嗜酸乳杆菌对永生化山羊子宫内膜上皮细胞体外黏附的条件。【方法】通过革兰氏染色法,研究山羊子宫内膜上皮细胞的生长状态,嗜酸乳杆菌菌液浓度、菌体生长状态和pH值以及孵育时间对菌体黏附性能的影响。【结果】当山羊子宫内膜上皮细胞培养48 h,嗜酸乳杆菌菌液浓度为1.0×109mL-1,pH值为4.0,孵育时间120 min,嗜酸乳杆菌培养24 h时,嗜酸乳杆菌对山羊子宫内膜上皮细胞的黏附性最好。【结论】永生化山羊子宫内膜上皮细胞作为细菌黏附性能研究的体外模型是有效可行的。

为探讨昆白系孕鼠子宫内膜上皮细胞的分离与体外培养条件、生长特点及其增殖规律,采用2．5 mg／mL胰蛋白酶+0．4 mg／mL EDTA分别以20,30,40 min消化子宫内膜,结合刮取法,对昆白系孕鼠子宫内膜上皮细胞的分离培养进行了研究。结果表明,随着消化时间的增加,所获得的细胞数目也增多,但细胞活力下降(噻唑兰法检测);消化30min所获得的细胞活力高、数目多,细胞比较单一;子宫内膜上皮细胞的活力随着细胞培养代数的增加而下降。

对山羊子宫内膜基质细胞进行分离与体外培养,研究其生长特性,并对其进行免疫细胞化学染色鉴定。结果表明,山羊子宫内膜在37℃条件下,以2 g／L的胶原酶Ⅰ型消化3～4 h效果最好;采用过滤—低速离心—沉降相结合的方法分离山羊子宫内膜基质细胞效果较好,所得细胞在培养后0．5 h开始贴壁,培养12 h后,可见梭形和多角形2种形态的细胞,3～4 d呈网状铺满皿底,有明显的重叠生长现象;免疫细胞化学染色显示这2种形态的细胞均表达波形蛋白,阳性率可达95％以上,不表达角蛋白。说明采用本文所述的消化和分离方法可获得高纯度的子宫内膜基质细胞。

为探究干扰素刺激外切酶基因20(ISG20)在肉牛子宫内膜上皮细胞容受态形成中的表达及功能分析。采用RT-PCR结合测序技术获得肉牛ISG20基因的CDS区，利用生物信息学在线工具进行了ISG20基因及其所编码的蛋白质的序列分析，并利用qRT-PCR检测了ISG20基因及其相关基因在肉牛子宫内膜上皮细胞容受态形成中的表达量。结果显示，ISG20基因的CDS区长度为516 bp,可编码一条由176个氨基酸组成的无跨膜结构域且不稳定的碱性亲水性单体蛋白质。该蛋白质含有1个DEDD核酸外切酶超家族结构域，与ISG15和MX2等10种蛋白质相互作用，主要在细胞质中发挥作用。此外，qRT-PCR结果表明，与对照组相比，ISG20基因及其相关的ISG15和MX2在孕酮(P4)联合干扰素-tau(IFN-τ)诱导的肉牛子宫内膜上皮细胞容受态形成中的表达量均显著上调。ISG20可能参与肉牛子宫内膜上皮细胞容受态的形成，并在早期妊娠等生物学过程中发挥作用。

[目的]建立永生化猪视网膜色素上皮细胞系,为病毒学研究提供一种新的细胞材料。[方法]合成猪腺病毒3型E1基因,将其克隆至真核表达质粒pCI-neo中,构建E1基因真核表达质粒pCI-neo-E1,进行PCR和测序鉴定。提取pCI-neo-E1质粒,转染原代猪视网膜色素上皮细胞,用新霉素G418筛选猪永生化视网膜色素上皮细胞系(RPECs)。检测RPECs的角蛋白18和19,通过细胞计数测定其生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期,并对其进行染色体核型分析。分别将猪流行性腹泻病毒(PEDV) CV77毒株、猪圆环病毒2型(PCV2) DBN-SX07株和猪伪狂犬病毒(PRV) Bartha-K61株接种RPECs,同时将PEDV CV77毒株接种绿猴肾细胞(Vero细胞),将PCV2 DBN-SX07株接种猪肾细胞(PK15细胞),将PRV Bartha-K61株接种仓鼠肾成纤维细胞(BHK细胞),观察细胞病变效应(CPE),并采用间接免疫荧光法测定病毒的滴度。[结果]PCR和测序结果显示,真核表达质粒pCI-neo-E1构建成功。将pCI-neo-E1转染原代猪视网膜色素上皮细胞,经G418筛选得到永生化细胞株,该细胞株表达角蛋白18和19,传代50代仍保持上皮样细胞形态,增殖活性良好,细胞周期及染色体核型特征与正常的二倍体细胞一致。PEDV CV77毒株感染猪RPECs 24 h后,CPE明显,滴度为10~(5.25)TCID_(50)/mL,低于其在Vero细胞中的滴度(10~(8.125) TCID_(50)/mL)。PCV2 DBN-SX07毒株感染猪RPECs后可产生明显CPE,病毒滴度为10~(6.125)TCID_(50)/mL,略高于其在PK15细胞上的滴度(10~(6.0)TCID_(50)/mL)。PRV Bartha-K61毒株感染猪RPECs后,CPE明显,病毒滴度为10~(8.75) TCID_(50)/mL,略低于其在BHK上的滴度(10~(8.875) TCID_(50)/mL)。[结论]成功构建了永生化猪视网膜细胞系,可用于猪源病毒的培养,尤其是培养PCV2可产生明显CPE,易于观察,为后续开展疫苗工艺的提升提供了一种新的细胞材料。

采用组织块移植法,对尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)的肾脏组织细胞进行原代培养,建立了罗非鱼肾脏细胞系,已稳定传代培养50代以上,命名为TiK。罗非鱼肾脏细胞系为纤维样细胞,其最佳培养基为DMEM,最适培养温度为28℃,最适血清浓度为15%。在最适培养条件下,罗非鱼肾脏细胞系的群体倍增时间为45.8 h。细胞经液氮冷冻保存6个月后进行复苏,经台盼蓝染色,约(89.84±3.48)%的细胞具有活性,复苏后细胞生长旺盛。染色体分析显示,第32代罗非鱼肾脏细胞系染色体数目分布在20～66之间,众数为48。使用本实验室分离鉴定的罗非鱼病毒感染罗非鱼肾脏细胞,可产生典型的细胞病变效应,表明罗非鱼肾脏细胞对该病毒敏感。该细胞系的建立为罗非鱼病毒病防控技术研究提供了重要的实验材料。

为研究克隆黄淮白山羊耳部皮肤成纤维细胞(cGSF)的体外培养及其生物学特性。通过组织块接种培养法和胰蛋白酶消化法均可以获得原代cGSF,但在接种培养24 h后,组织块法收获的细胞贴壁率和细胞量要明显高于胰酶消化法。就生长特征而言,cGSF的生长曲线也呈现典型"S"型,到达指数增长期、平台期的时间分别为第3,6天,早于普通黄淮白山羊的皮肤成纤维细胞(GSF),后者分别为第4,8天。cGSF原代(P0)、第2代(P2)、第8代(P8)细胞的染色体数目异常率均高于相同代数的GSF。在相同转染条件下,cGSF在转染p EGFP-N1后,再经G418筛选亦可形成克隆点,扩增获得阳性细胞系。总之,源自克隆...

【目的】以滩羊胎儿皮肤组织为材料,获得符合体细胞克隆转基因基本要求的供体细胞系。【方法】取滩羊胎儿皮肤组织,采用组织块法分离培养获得滩羊胎儿成纤维细胞,观测其形态和生长情况,鉴定其性别,并对其染色体核型和红色荧光报告基因质粒(pmCherry-N1)转染等生物学特性进行研究。【结果】采用组织块法成功获得了滩羊胎儿成纤维细胞,其细胞群体倍增时间(PDT)约为48h;5代、15代、25代滩羊胎儿成纤维细胞核型分析表明,各代细胞染色体均为2n=54,未见异常;滩羊胎儿成纤维细胞的转染效率较高,约为50%,对最终获得的稳定表达红色荧光蛋白的胎儿成纤维细胞进行核型分析,结果证明遗传物质没有发生变化。【结...

为研究鱼类骨组织细胞的特征,实验建立了团头鲂骨组织细胞的体外分离培养方法,并对其生物特性进行了鉴定。以3月龄团头鲂尾椎骨及肋骨为实验材料,利用组织块培养法和胰蛋白消化法分别进行骨组织细胞培养,确定最佳培养条件:采用组织块培养法,28°C培养,M-199培养基中加入体积分数为20%的胎牛血清、25 ng/m L表皮生长因子EGF和25 ng/m L碱性成纤维生长因子b FGF。细胞生物学特性鉴定结果显示:细胞碱性磷酸酶、钙化结节茜素红染色及矿化结节von Kossa氏法染色均呈阳性,表明所培养的细胞具有典型

采用组织块移植培养技术，对来源于青鱼（Ｍｙｌｏｐｈａｒｙｎｇｏｄｏｎ ｐｉｃｅｕｓ）的鳍条组织细胞进行原代培养，建立了青鱼鳍条组织细胞系，定名为Ｂｃ－Ｆｉｎ。青鱼鳍条组织细胞为成纤维样细胞，已稳定传代培养５０多代，其最适培养温度为２５℃，最佳培养基为ｌ－１５，最适血清浓度为１５％，在最适培养条件下，青鱼鳍条组织细胞的群体倍增时间为６０．６ ｈ。青鱼鳍条组织细胞液氮冷冻保藏６个月后，经台盼蓝染色，约（９０．０９±４．６５）％的细胞具有细胞活性，复苏后的细胞生长旺盛。细胞染色体分析显示，第１６代青鱼鳍条组织细胞的染色体数目为正常二倍体（２ｎ＝４８），第４１代细胞染色体众数为４６。通过对离体培养细胞．．．

为研究乳腺上皮细胞增殖和分化特性及其基因表达的分子机制 ,建立了山羊乳腺上皮细胞培养体系。用无菌手术法从健康第二胎泌乳期山羊乳腺取得组织块 ,在体外条件下用组织块法进行原代培养。基础培养液用 RPMI1 6 4 0 ,含胎牛血清 1 5 0 m L/ L,添加 EGF(1 0 μg/ L)、胰岛素 (0 .1 m g/ L)、E2 (1 μg/ L)、氢化可的松 (0 .1mg/ L)、孕酮 (1 m g/ L)、青霉素 (0 .1 g/ L)及链霉素 (0 .0 5 g/ L) ,在铺有胶原的塑料培养板上培养。从细胞接种存活率、细胞群体倍增时间、细胞生长曲线和细胞分裂指数 4个方面考察了乳腺...

以妊娠前后的牦牛子宫为材料,应用免疫组织化学SP法,研究波形蛋白(Vimentin)、泛角蛋白(CKs)和角蛋白7(CK7)能否成为牦牛子宫内基质细胞和上皮细胞的特异标记物。结果表明,Vimentin可作为妊娠前后牦牛子宫基质细胞标记蛋白;CKs可标记妊娠前后牦牛子宫腺上皮、腔上皮细胞和妊娠早期尿囊内层细胞;CKs和CK7均可标记妊娠早期牦牛尿囊外层细胞。

采用组织块移植培养技术,对来源于斑点叉尾(Ictalurus punctatus Rafinesque)肾脏组织的细胞进行原代培养,建立了斑点叉尾肾脏组织细胞系,定名为CCK,目前已稳定传代培养70多次。斑点叉尾肾脏组织细胞为成纤维样细胞,最佳培养基为M199,最适培养温度范围为28～32℃,培养基血清体积分数为10%。在此条件下,CCK细胞的倍增时间为38.9～41.0h。斑点叉尾肾脏细胞的集落形成效率为(74.16±3.54)%,第9代传代细胞的染色体数目为正常二倍体2n=58,第33代传代细胞的染色体众数为60。液氮冷冻保存6个月后复苏的细胞经台盼兰染色检验,(86.69±1.0...

【目的】探讨复方益母生化散对奶牛子宫内膜炎的作用机理。【方法】体外实验:分离奶牛子宫内膜细胞,细菌脂多糖(LPS)诱导子宫内膜细胞炎症模型,复方益母生化散处理子宫内膜炎症细胞48h、72h,Western blotting法检测CYP450的表达;体内实验:复方益母生化散栓剂治疗患有子宫内膜炎的奶牛,检测血清中IgG、IgA含量的变化。【结果】复方益母生化散处理后,子宫内膜炎症细胞CYP450的表达随复方益母生化散剂量的增加而呈升高的趋势,血清中IgG、IgA的含量与对照组相比明显升高。【结论】2000μg·mL-1的复方益母生化散作用奶牛子宫内膜炎症细胞48h,CYP450的表达最明显。