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[期刊] 华北农学报
[作者]
许长蔼 张要武 向开军 李爱华
报道了水蛭素全基因的合成及克隆。根据已知水蛭素氨基酸序列及酵母菌体内蛋白质表达特性 ,设计了水蛭素的全基因序列 ,采用化学合成及酶学相结合的方法 ,合成了该基因片段 ,并逐段克隆至载体 pBS上 ,得到全长水蛭素基因。序列测定表明 ,克隆后DNA顺序同原设计序列。
关键词：
水蛭素 基因 合成 克隆
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
刘忠松 孙东红 刘显军 官春云
原花色素是类黄酮生物合成途径的终端产物,其基因调控网络在拟南芥、葡萄等基因组已经测序的植物中得到充分阐释。种皮中原花色素的积累与种子颜色、种子休眠和寿命有关。油菜种皮中原花色素的积累决定种皮颜色,同时影响种子的油分含量。本文综述了通过图位克隆、同源克隆和电子克隆等途径克隆油菜原花色素合成途径基因的进展,分析了在油菜中已经克隆的部分原花色素合成途径基因与种皮颜色的关系,提出了如何利用已经公开的油菜、白菜基因组序列通过筛选BAC文库得到基因不同拷贝的全长序列的综合路径,列举了笔者运用该方法已经克隆的部分原花色素合成途径基因拷贝数,以期揭示油菜原花色素形成积累的基因调控网络。
关键词：
油菜 原花色素合成 基因克隆
[期刊] 华北农学报
[作者]
王力 张娜 张秀清 孙君社
自然条件下金丝桃素在植物中的含量较低且不稳定,提取工艺受其他物质的影响较大,在一定程度上限制了金丝桃素在医药、食品等领域的应用。为了研究金丝桃素合成途径并实现其体外转化,以贯叶连翘愈伤组织总RNA为模板,经RT-PCR扩增得到了编码金丝桃素合成酶的全长cDNA,即Hyp基因。将该基因克隆到原核表达载体pET30a中,成功构建金丝桃素合成酶表达载体pET30a-Hyp,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。含有重组质粒的克隆在IPTG诱导下,表达出金丝桃素合成酶融合蛋白,利用Ni柱纯化菌体裂解上清中表达的融合蛋白,对纯化产物进行SDS-PAGE分析,结果Hyp基因得到了高效表达,大小约为20 k...
关键词：
金丝桃素 贯叶连翘 金丝桃素合成酶
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
徐凤凤 向娟 李双桃 石锦 李殿波 连蔚然 赵冰 郭仰东
为研究甘蓝纤维素合成酶ＢｏＣｅｓＡ基因在干旱胁迫下的表达模式，通过同源克隆得到甘蓝纤维素合成酶基因的ＣＤＮＡ全长，利用生物信息学软件分析该基因的特征；构建含ＢｏＣｅｓＡ和ＧＦＰ的融合表达载体，通过基因枪转化洋葱表皮细胞试验对该基因进行亚细胞定位；利用荧光定量ＰＣＲ分析基因在不同组织中的表达情况及干旱胁迫下的表达模式。甘蓝纤维素合成酶ＢｏＣｅｓＡ基因的ＣＤＮＡ全长为２ ７２１ＢＰ，编码９０６个氨基酸，在Ｎ端含有锌指结构域和２个跨膜区，Ｃ端含有６个跨膜区，除包含植物纤维素合成酶基因共有的保守区外，还包含２个高突变区。通过氨基酸序列比对分析，发现甘蓝的该基因与拟南芥的ＡｔＣｅｓＡ３基因同源性较高。亚．．．
[期刊] 林业科学研究
[作者]
李泽华 杜娟 贺学娇 赵树堂 刘颖丽 卢孟柱
[目的]DET2基因编码一个5α-还原酶,是油菜素内酯(BRs)合成过程中的关键限速基因。研究DET2基因在杨树生长发育中的作用,对于进一步研究油菜素内酯在木本植物中的调控机制有重要意义。[方法]从银腺杨84K(Populus alba×P. glandulosa,‘84K’)克隆得到拟南芥AtDET2同源基因PagDET2,利用生物信息学对其进行序列比对、生化特征分析、构建系统发育进化树。通过RT-PCR分析其在杨树中的表达模式。构建由CaMV 35S强启动子驱动的过表达载体,通过农杆菌介导的叶盘转化法转化84K杨,得到PagDET2-OE转基因植株。分析过表达DET2基因对于转基因植株内源BRs含量、植株生长和抗逆的影响。[结果]克隆了包含全长编码区PagDET2基因全长,可编码一个长度为257个氨基酸的蛋白质。其蛋白序列与毛果杨、拟南芥、水稻、棉花、大豆、番茄DET2蛋白同源性较高,说明该基因在进化过程中相对保守。PagDET2在84K杨不同组织中均检测到表达,其在茎中的表达较高。通过ELISA检测植物BRs含量发现,过量表达DET2可以显著提高杨树内源BRs含量。过量表达DET2基因,可以导致转基因植株的高生长,但对盐胁迫更加敏感。[结论]DET2基因作为BRs合成的关键基因,在杨树中过量表达可以显著提高内源BRs含量,促进植株增高。DET2转基因植株的获得为进一步分析BR参与木本植物生长发育的调控机制奠定了基础。
[期刊] 中南林业科技大学学报
[作者]
刘增才 唐玉倩 佟鑫宇 邹莉
【目的】对参与暴马桑黄赤霉素合成途径关键酶-牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶（geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPS）基因进行克隆及诱导表达研究，以期深入了解暴马桑黄的生长发育机制，为获得优质高产的暴马桑黄菌株提供理论依据。【方法】采用PCR扩增技术获得暴马桑黄GGPS基因cDNA全长及启动子序列，利用生物信息学软件对序列进行分析；qRT-PCR技术分析不同浓度茉莉酸甲酯（methyl jasmonate,MeJA）对暴马桑黄GGPS基因转录水平的影响，并用分光光度计测定不同浓度MeJA诱导下赤霉素含量的变化；电子天平称量暴马桑黄菌丝体生物量；SDS-PAGE检测暴马桑黄GGPS基因原核表达情况。【结果】将克隆得到的暴马桑黄GGPS启动子和基因分别命名为SbGGPS启动子和SbGGPS基因。SbGGPS启动子分析结果显示，除了含有CAAT-box、TATA-box典型的启动子作用元件之外，还含有MeJA响应元件。基因分析发现，SbGGPS基因cDNA序列全长945 bp，共编码314个氨基酸，蛋白相对分子量35.89 k Da，不存在信号肽和跨膜结构。荧光定量分析、赤霉素含量测定及生物量检测结果表明，SbGGPS基因转录水平、赤霉素含量及生物量均随着MeJA浓度增加呈现显著下降的趋势，三者变化趋势基本一致，并且两两之间均呈显著正相关。SDS-PAGE结果显示，SbGGPS基因能够在原核系统中成功表达出蛋白。【结论】通过对SbGGPS基因的克隆及诱导表达分析发现，该基因在暴马桑黄赤霉素生物合成及生长发育过程中具有重要作用。
[期刊] 浙江农林大学学报
[作者]
庞景 童再康 黄华宏 林二培 刘琼瑶
通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)结合c DNA末端快速扩增(RACE)技术,从杉木Cunninghamia lanceolata中克隆到2个全长为3 235 bp和3 876 bp的纤维素合成酶基因c DNA序列,被分别命名为Cl Ces A1和Cl Ces A2,Gen Bank登录号分别为JQ844574和JQ844575。相应编码蛋白分别包含992和1 092个氨基酸残基,推测分子量为111 845.3 D和123 105.7 D,等电点为6.04和6.65。氨基酸序列分析发现,它们具有植物纤维素合成酶基因相应的结构特征——锌指结构,2个易变区CSRI和CSRII,2个保守区CR...
[期刊] 中南林业科技大学学报
[作者]
左涛 包海 陈慧 苏衍修 常聚普 郭利民 贺伟 王延伟
无色花色素还原酶基因（Ｌｅｕｃｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，Ｌａｒ）是类黄酮生物合成途径中的一个重要基因，为了验证杨树中Ｌａｒ的功能，明确Ｌａｒ基因对抗病物质儿茶素合成的影响，本实验以接种后第６ ｄ的一年生‘中林４６’杨树树干的树皮为材料，利用ｒｔ－Ｐｃｒ技术克隆了Ｌａｒ基因的ｏＦｒ序列，并构建Ｌａｒ的过表达载体Ｐ ｃａＭＢｉａ１３０１－Ｌａｒ。采用农杆菌介导的叶盘法转化烟草，获得了转Ｌａｒ基因的烟草６株。用ｑ ｒｔ－Ｐｃｒ检测转基因烟草的表达量，结果显示，在转基因植株中，Ｌａｒ基因的表达量均显著上调。用高效液相色谱法检测转基因植株中的儿茶素含量，结果显示，６株转Ｌａｒ的烟．．．
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
陈萌 徐敏 王业民 白亭丽 毕德玺 邓子新 陶美凤
通过基因组粘粒文库的高通量接合转移、异源表达和生物活性测定，结合ＤＮＡ序列测定，从刺孢吸水链霉菌ＡＡ９７０２６中筛选具有广谱抗菌活性的小分子化合物及其生物合成基因簇，获得１个对革兰氏阳性细菌和红酵母均有抑制活性的阳性克隆１Ｈ５，其部分ＤＮＡ序列与链丝菌素生物合成基因相似。含１Ｈ５的异源链霉菌宿主的发酵液均能检测到链丝菌素的不同组份，表明１Ｈ５含有完整的链丝菌素生物合成基因簇。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王壮壮 董邵云 周琪 苗晗 刘小萍 徐奎鹏 顾兴芳 张圣平
【目的】鉴定调控黄瓜果实中L-半乳糖途径维生素C(Vc)合成相关基因的位置、数量及表达特征，同时对关键基因进行克隆分析，旨在为黄瓜果实中Vc合成调控研究奠定基础。【方法】根据已报道的拟南芥中L-半乳糖途径合成Vc相关基因，利用蛋白编码的氨基酸序列在黄瓜9930＿V2参考基因组数据库中进行BLAST比对，确定黄瓜中的同源基因，借助TBtools软件绘制基因在染色体上的位置。通过q RT-PCR分析上述基因在果实Vc含量差异显著的两份黄瓜材料中的表达量。利用PCR扩增对限速酶GDP-L-半乳糖磷酸化酶（GGP）及GDP-甘露糖-3′5′-差向酶（GME）同源基因进行克隆，测序分析这些基因在高Vc含量与低Vc含量黄瓜果实中的序列差异。构建系统进化树，分析黄瓜果实GME、GGP与其他物种中同源基因的亲缘关系。【结果】在黄瓜基因组中比对到21个参与L-半乳糖途径合成Vc相关酶PMI、PMM、GMPase、GME、GGP、GPP、Gal DH、Gal LDH的同源基因，7条染色体均有分布，在5号染色体和1号染色体上分布最多。通过对21个基因在两份果实Vc含量高低差异显著的两份材料CG45（高Vc含量）和R48（低Vc含量）的表达量分析，发现调控PMI、PMM、GMPase、GME、Gal LDH这5个酶的基因在CG45和R48中有极显著的表达差异。对Vc合成限速酶GGP和GME相关基因在CG45和R48两份材料中进行克隆发现，Cs GME2在R48中基因全长为3 537 bp，在CG45中基因全长为3 541 bp，该基因在两份材料存在多个SNP位点差异和Indel差异，有一个突变位点位于CDS区，且导致了氨基酸序列的改变。通过对调控Vc合成限速酶GME、GGP蛋白性质分析，发现限速酶GME、GGP在不同物种的蛋白性质差异不大，均为亲水性蛋白，功能相对保守。进化树分析发现不同物种亲缘关系较近的聚类在一起，进化过程高度保守。【结论】鉴定出21个分布于7条染色体上的黄瓜果实Vc合成的L-半乳糖途径相关基因，推测关键酶PMI、PMM、GMPase、GME、Gal LDH、GGP可能影响黄瓜果实中Vc含量变化，调控Vc合成限速步骤关键酶GME、GGP功能相对保守，Vc合成限速步骤关键酶GME基因Cs GME2在高Vc和低Vc两份材料中的一个SNP位点变异导致氨基酸序列的变化。
关键词：
黄瓜 Vc 基因克隆 表达分析
[期刊] 西南农业学报
[作者]
石萍 游华建 邓小书 陈仕江 鲁增辉
【目的】探究日本医蛭在不同摄食阶段、各个组织（唾液腺、肠、嗉囊、皮肤及精卵巢）中水蛭素基因（hirudin）的时空表达模式，以期为水蛭药材的科学合理利用提供理论依据。【方法】基于课题组前期的水蛭唾液腺转录组数据筛选结果及基因克隆获得的水蛭素基因序列信息，利用实时荧光定量PCR方法，对水蛭关键活性成分的编码基因hirudin在不同摄食阶段、不同组织中的表达量进行检测分析，研究该基因的时空表达模式。【结果】水蛭素基因（hirudin）在日本医蛭的唾液腺、肠、嗉囊、皮肤及精卵巢组织中均有表达，且在唾液腺中的表达量显著高于其他组织；Hirudin基因在不同摄食阶段的唾液腺组织中表达结果显示，摄食后第2天表达量显著升高，之后随着摄食时间的推延而出现下降趋势；Hirudin基因在嗉囊、肠中的表达量呈先升高后下降的趋势，分别于摄食后第1天、第2天达到最高，之后会随着停食时间延长而呈现下降趋势，尤其是在摄食后第7天、第8天的表达量呈现显著性降低；Hirudin基因在皮肤组织中也有表达，并随着停食时间的延长呈先升后降的趋势，最高峰出现在摄食后第2天；在精卵巢组织中，摄食期间hirudin基因的表达量最高，与其他摄食阶段的表达呈现显著性差异。【结论】水蛭素基因hirudin在日本医蛭的唾液腺、肠、嗉囊、皮肤和精卵巢组织中均有不同程度的表达，在唾液腺中的表达量显著高于其他组织。摄食行为及食物刺激可能影响水蛭素基因（hirudin）的表达，在不同摄食阶段的表达量存在显著差异。研究结果可为水蛭药材的科学采收加工、提取部位的科学选取、合理入药提供理论依据和技术支撑，对未来水蛭药材资源的可持续利用具有重要的参考价值。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
兰秀锦 龙海 刘千 颜泽洪 魏育明 刘登才 郑有良
RSP是用抗穗发芽的节节麦与圆锥小麦合成的人工六倍体小麦Triticumturgidum-Aegilopstauschii),其抗穗发芽特性在维持小麦面粉加工品质方面有着潜在的重要价值。为了了解其低分子量谷蛋白这一对小麦加工品质有直接重要影响的蛋白组分情况,本研究采用PCR法从合成小麦RSP中克隆得到3个低分子量谷蛋白亚基(LMW-GSs)基因,命名为LMWRSP-1、LMWRSP-2和LMWRSP-3。基因序列GenBank登录号分别为AY676681、AY676682和AY676683。其中,LMWRSP-1和LMWRSP3的编码区长度分别为825bp和915bp,可分别编码274和304...
[期刊] 华北农学报
[作者]
何美敬 刘立峰 穆国俊 侯名语 陈焕英 崔顺立
蔗糖合成酶(Sucrose Synthase,SuSy)是蔗糖代谢途径中的关键酶,在植物生长、发育和渗透调节过程中起着重要作用。为揭示蔗糖合成酶基因在花生中的抗逆机理,以花生基因组DNA为模板,利用染色体步移技术(GenomeWalking)中的TAIL-PCR技术扩增花生SuSy基因组序列和启动子区域,得到基因组序列6 189 bp,启动子预测分析表明,该序列包含约800 bp的启动子上游调控序列,13个外显子,12个内含子。启动子元件分析显示,该片段含有典型的TATA-box、CAAT-box,并存在低温响应元件LTR、GA响应元件、干旱响应MYB结合位点、厌氧诱导必要的顺式作用元件ARE...
[期刊] 草业科学
[作者]
张婷婷 刘洋 张鹤山 许本波
为研究白三叶类黄酮合成途径的关键基因TrCHI在白三叶(Trifolium repens)花色形成中的作用，以白三叶野生型和红花突变体为材料，通过同源克隆得到TrCHI基因并进行转录分析和CHI酶活性测定。结果表明，白三叶野生型TrCHI基因开放阅读框长660 bp，编码219个氨基酸，其红花突变体TrCHI开放阅读框长度为669 bp，编码222个氨基酸。7处氨基酸突变包括：第13号位的谷氨酸突变成天冬氨酸，第75号位的谷氨酸突变成谷氨酰胺，第154号位的丝氨酸突变成苏氨酸，第218号位的赖氨酸突变成精氨酸，并在末尾增加了甘氨酸、蛋氨酸和赖氨酸。进化分析发现，CHI基因进化具有物种保守性，Tr CHI属于Ⅱ型CHI。花瓣、根和叶柄中，红花突变体TrCHI转录水平显著高于野生型；但在茎、叶和花梗中，红花突变体TrCHI基因转录水平低于野生型。突变体花瓣中CHI酶活性极显著高于野生型(P <0.001)。推测白三叶突变体的红花表型与TrCHI基因突变并对白三叶中的类黄酮化合物的合成调控有关。本研究为进一步研究TrCHI在白三叶上的潜在功能提供了一定的价值。
[期刊] 华北农学报
[作者]
张帅 张明 寇天舒 马俊莲 唐霞 张子德
为进一步利用基因工程手段调控无花果乙烯的合成,以无花果果肉为材料提取基因组DNA,根据已报道的无花果ACC合成酶基因序列设计引物,采用PCR技术扩增得到一条约600 bp的特异片段,将该片段克隆到pGM-Teasy vector上经PCR、酶切和测序鉴定。序列分析结果表明,基因全长590 bp,编码196个氨基酸,该序列与GenBank上已登陆的Masui Dauphine-ACS1的cDNA序列同源性达99%,氨基酸同源性达98%。结果表明,成功克隆到了无花果ACS基因片段。
关键词：
无花果 ACC合成酶 基因克隆 序列分析
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