【目的】分离水稻WRKY80,分析其编码蛋白的序列结构特征,了解其在各器官中以及病原接种、激素处理下的表达模式,为阐明其生物学功能奠定基础。【方法】基于水稻基因组数据库注释的Loc_Os03g63810基因的编码序列设计特异引物,用RT-PCR法从茉莉酸甲酯(MeJA)处理的水稻叶片中克隆WRKY80 cDNA序列,运用生物信息学手段对推定的蛋白和启动子序列进行分析,用Northern杂交或实时荧光定量PCR方法研究基因的表达模式。【结果】获得了WRKY80 cDNA序列,长1 392 bp,包含1个长1 164 bp的完整开放读码框,编码387个氨基酸。WRKY80具有1个典型的WRKY保守...

【目的】分离水稻WRKY30,为阐明WRKY转录因子在水稻抗病反应中的调节作用提供依据,为抗病性的合理利用和品种遗传改良提供基因材料。【方法】采用RT-PCR获得包含最大开放阅读框(ORF)的WRKY30 cDNA序列,运用生物信息学手段进行序列分析,通过Southern杂交确定基因在基因组中的拷贝数,利用Northern分析或RT-PCR方法,研究基因的器官特异性表达和病原、激素以及非生物胁迫诱导表达的特征。【结果】WRKY30包含一个长2 022 bp的完整ORF,编码674个氨基酸,具有1个核定位信号和2个典型的WRKY保守结构域,锌指纹组成为C2H2,归类于WRKY第一组,与大麦、高粱...

为鉴定逆境应答相关转录因子,以1个水稻EST为基础,通过RT-PCR分离到了1个编码锌指蛋白的转录因子新基因的全长cDNA,命名为OsZF19。该基因编码171个氨基酸,包含zf-AN1和zf-A20两个锌指结构域,预测的该基因启动子区含有逆境应答顺式元件。Northern杂交分析表明,OsZF19的确受到高盐和植物激素ABA胁迫的诱导,而在干旱胁迫早期显著地诱导表达,胁迫后期OsZF19的表达量轻微下降。试验结果表明,OsZF19可能在水稻对干旱和高盐逆境的应答反应中发挥作用。

为了阐明水稻膜联蛋白基因家族成员OsAnn8在干旱和低温胁迫条件下的功能作用机制,通过荧光定量PCR技术对不同干旱和低温处理下的水稻叶片中OsAnn8基因进行转录水平上的定量分析,结果表明,OsAnn8基因在干旱胁迫处理前后表达量呈现出高-低-高的变化趋势,而在冷胁迫处理前后表达量则呈现出低-高-低-低的变化。随后,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对OsAnn8基因进行定点编辑,并借助农杆菌介导将OsAnn8基因靶位点的CRISPR/Cas9基因编辑植物表达载体导入转基因受体品种TP309,经潮霉素筛选后共获得32株转基因阳性植株,靶位点扩增测序峰图分析表明其中的2个单株出现了重叠峰,进一步的T载体克隆分别测序表明,这2个单株为单等位基因敲除,说明本研究已经成功获得了OsAnn8基因靶位点敲除的单等位突变体,不同类型的水稻OsAnn8基因突变体的创建,为水稻膜联蛋白基因家族成员OsAnn8在非生物胁迫条件下的功能研究奠定了材料基础。

【目的】蛋白酶抑制剂(protease inhibitor,PI)是一类广泛存在于植物中的蛋白质,具有抵御植食性昆虫取食危害的功能。然而,水稻(Oryza sativa)PI基因在二化螟(Chilo suppressalis)取食过程中的表达模式尚不清楚。本研究旨在分析水稻蛋白酶抑制剂基因OsLTPL164和OsLTPL151在二化螟取食及机械损伤下的表达模式,为明确OsLTPL164和OsLTPL151在水稻防御二化螟中的作用及今后利用这两个基因构建转基因水稻株系打下基础。【方法】以东北地区常规种植的3个水稻品系辽盐2号(1654)、辽星17号(1665)和长白17号(1688)为研究对象,在二化螟危害关键时期(分蘖期)通过机械损伤和接虫处理,在处理后不同时间(0、3、6、12、24、48、72 h)分别对根、茎、叶3个组织进行取样,利用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测3个水稻品系中OsLTPL164和OsLTPL151的表达模式。【结果】OsLTPL164在3个品系中的组织表达模式一致,在叶片和茎中的表达量均高于根部;OsLTPL151在3个品系中的组织表达模式不一致,在1654品系中茎和叶片中的表达量显著高于根部,但在1688和1665品系中根部的表达量显著高于茎和叶片;此外,这两个基因在3个品系间的相同组织中都有不同的表达模式,OsLTPL164在根、茎、叶中均呈现在1665品系中表达量最高、在1688品系中表达量次之、在1654品系中表达量最低的表达模式,但OsLTPL151在不同组织中的表达模式与OsLTPL164不同:在根中,OsLTPL151在1665品系中的表达量明显高于1688和1654品系;在茎中,OsLTPL151在1654和1665品系中的表达量明显高于1688品系;在叶中,OsLTPL151在1654品系中的表达量明显高于1665和1688品系。二化螟取食诱导OsLTPL164和OsLTPL151在3个品系的叶片中表达上调幅度高于茎和根,且在1665品系中上调的幅度较1688和1654品系中大。在二化螟取食和机械损伤处理不同时间后,两个基因均呈现表达水平先上升后下降再上升的趋势;OsLTPL164和OsLTPL151在机械损伤6 h后才被显著诱导表达,而二化螟取食3 h后便可诱导OsLTPL164和OsLTPL151上调表达。【结论】OsLTPL164和OsLTPL151在3个水稻品系中二化螟取食以及机械损伤均能诱导其表达,推测这两个基因可能与水稻抗二化螟有关,但这两个基因在不同水稻品系中其他具体的功能可能有所不同。

茉莉花JsMYB108转录因子可以调控茉莉萜类合成酶基因JsTPS2的表达，是香气合成相关的转录因子.本试验将茉莉JsMYB108转录因子的编码序列利用酶切连接方法构建到原核表达载体pGEX-4T-1上，转化大肠杆菌BL21(DE3)株系，设定了4个IPTG诱导浓度(0.1、0.2、0.5、1.0 mmol·L~(-1))和3个诱导温度(20、28、37℃)用于筛选合适的蛋白诱导条件，在此基础上对诱导出来的蛋白进行分离纯化和检测.结果表明：4个IPTG浓度均可成功诱导出分子质量约为59 ku的融合蛋白，不同IPTG浓度间诱导表达的蛋白量无显著差异；20、28、37℃均可诱导出融合蛋白，但相比28、37℃的诱导温度，20℃过夜诱导表达下的可溶性蛋白含量最高，更有利于重组蛋白的纯化.后续用0.1 mmol·L~(-1) IPTG、20℃作为大量诱导JsMYB108融合蛋白的条件，利用GST亲和树脂分离纯化了融合蛋白，并通过Western blotting对纯化的蛋白进行了验证.研究结果可为后期筛选JsMYB108互作蛋白及其蛋白功能的研究提供参考.

[目的]探讨气培条件下,IAA极性运输对水稻根毛形成及水通道蛋白基因表达的影响。[方法]以超表达OsPIN1a的转基因水稻和野生型水稻为研究材料,当种子根长为0.5—1.0 cm时,分别用不同浓度IAA、IAA和生长素极性运输输出载体抑制剂、IAA和生长素输入载体抑制剂复合处理的琼脂块贴在根尖一侧,黑暗条件下培养12 h后观察根毛生长情况,测定根毛的密度、长度及根毛形成后根尖部分相对含水量,并用激光共聚焦显微镜观察根尖及根毛内的OsPIN1a-GFP亚细胞定位,再通过半定量RT-PCR检测根毛形成前后水通道蛋白基因表达。[结果](1)在0—5.0 mg·L-1 IAA浓度范围内,随IAA浓度增...

【目的】鉴定毛竹Phyllostachys edulis磷转运蛋白Ⅰ(phosphate transporter 1, PHTⅠ)家族基因，分析其表达模式。【方法】利用生物信息学方法，鉴定毛竹PHTⅠ家族成员，分析基因启动子调控元件、编码蛋白的理化性质、基因结构、氨基酸保守基序、基因在染色体的位置、组织表达特异性、基因适应性进化及系统进化等。【结果】毛竹中共鉴定出20个PHTⅠ家族基因(PePHTs)，分布在10条染色体上，均定位于细胞膜。每个基因都含有1～2个内含子，PePHTs启动子序列中包含干旱、低温等非生物胁迫以及赤霉素等激素类响应元件。毛竹PHTⅠ大部分为碱性蛋白质，分子量为48.61～71.89 kDa，理论等电点为6.84～9.30，疏水性值均大于0，都属于疏水蛋白。基因适应性进化分析显示：大多数PePHTs的选择压力值小于0，说明多数基因受到负选择压力。转录组表达图谱表明：PePHTs在不同组织中的表达存在差异性，说明该基因家族在毛竹生长发育过程中发挥着不同的作用。系统进化树表明：PePHTs都聚类在第Ⅰ亚家族，并且优先和水稻Oryza sativa聚类在同一支上。【结论】PHTⅠ家族在植物吸收和转运磷的过程中扮演了重要作用。本研究结果为深入研究毛竹PHTⅠ家族基因的功能奠定了理论基础。图5表1参45

【目的】氮素是植物生长发育必需的大量元素,铵态氮是根系可利用的主要氮源形式之一,铵态氮转运蛋白(AMT)在铵态氮的获取和运输中发挥着重要作用。速生是毛竹最主要的特点,鉴定其中的AMT基因,并对其结构和表达模式进行系统分析,为深入研究毛竹AMT家族基因在快速生长和环境适应性中的功能奠定基础。【方法】采用生物信息学方法鉴定毛竹AMT家族基因成员,对其系统发育、结构特征、组织表达特异性以及对激素和非生物胁迫应答进行分析,通过q PCR方法验证关键基因在干旱处理下的表达模式。【结果】在毛竹基因组中共鉴定出13个AMT家族基因,命名为PeAMT1-PeAMT13,其编码蛋白长度为408～497个氨基酸,亚细胞定位预测显示所有PeAMTs均定位于质膜上。系统发育分析表明,PeAMTs分为2个亚家族,不同亚家族之间具有各自的特异基序,但全部PeAMTs的Motif 2都包含了铵转运蛋白的典型保守序列。共线性分析结果表明,有8对PeAMTs存在共线性,而且11个PeAMTs与8个Os AMTs存在共线性,在进化过程中PeAMTs经历了纯化选择。PeAMTs具有组织表达特异性,多数在毛竹根部和叶片的表达水平最高,其次是发育初期的笋,在发育后期木质化程度较高的笋中表达水平较低。PeAMTs启动子中包含多种激素和非生物胁迫应答元件,GA3、油菜素内酯(BL)和干旱处理能引起多数PeAMTs表达量的显著变化,NAA和低温处理也能引起6个PeAMTs表达量的显著变化。筛选关键基因PeAMT1、PeAMT2和PeAMT3进行干旱处理下的q PCR验证,结果表明三者的表达变化均达到显著水平。【结论】毛竹中具有13个编码完整AMT的基因(PeAMTs),它们在结构特点和组织表达特异性方面均存在一定的差异,其表达受到激素和非生物胁迫的影响。PeAMTs可能通过在根部高表达协助毛竹从土壤中获取铵盐,在叶片中高表达对铵盐进行转移和回收,保证毛竹快速生长过程中充足的氮供应;同时可能在提高毛竹抗逆性中发挥铵解毒的功能。

根据相近物种的同类基因设计引物,从凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei肌肉组织中克隆获得原肌球蛋白基因(TPMS),长度为901bp,其中包含长度为852bp的完整开放阅读框,编码原肌球蛋白分子量为32.8kDa;RT-PCR结果显示,原肌球蛋白在心、肝胰腺、胃、鳃、肠和肌肉组织中均有表达,在肌肉中表达量最高,在鳃中表达量最低;将原肌球蛋白基因构建原核重组表达载体TPMS-pET30a,转化受体菌株BL21(DE3)并利用IPTG诱导后能够大量表达,蛋白分子量为38.2kDa;经优化,IPTG的最适诱导浓度为0.05mmol/L,最适诱导时间为4h;经过亲和纯化后,能够得到纯度9...

为了探讨高产四倍体水稻的不同遗传组成与品质的关系,以及蛋白质含量变化的原因,以国家优质品种美香占2号(MXZ2)、象牙香占(XYXZ)、矮脚南特二倍体(AJNT-2x)、高产同源四倍体水稻矮脚南特(AJNT-4x)以及高产新型四倍体水稻华多1号(H1)为试验材料,利用BCA法测定胚乳蛋白质含量、近红外谷物分析仪进行品质分析、全自动氨基酸分析仪测定氨基酸含量、qRT-PCR分析谷蛋白基因的表达差异。结果表明:AJNT-4x糙米、精米的蛋白含量分别为182.70,115.70 mg/g,高于国家优质品种MXZ2、XYXZ以及AJNT-2x,其营养品质大大提高;AJNT-4x的胶稠度为44.70 mm,低于MXZ2、XYXZ及AJNT-2x,且差异显著,其食用品质明显下降;而H1精米的蛋白含量最低,只有71.30 mg/g,但其胶稠度为112.70 mm,介于国家优质品种MXZ2与XYXZ之间。花后30 d AJNT-4x的17种氨基酸总量与人体必需氨基酸总量高于AJNT-2x与H1,H1的最低;H1的17种氨基酸总含量在花后15 d达到高峰,而AJNT-4x和AJNT-2x在花后20 d达到高峰,氨基酸含量积累过早停止导致H1在成熟期的总氨基酸含量下降,甚至低于AJNT-2x。在整个胚乳发育过程中,AJNT-4x、H1和AJNT-2x的4种贮藏蛋白积累趋势基本一致,但快速积累时间存在差异;AJNT-4x的谷蛋白快速积累的时间比AJNT-2x、H1早,且快速积累的时间长,导致AJNT-4x的蛋白含量最高。9个谷蛋白亚家族基因在花后5 d都有表达,随着胚乳的发育,各谷蛋白基因表达量逐渐升高、再逐渐下降并趋于稳定,不同的亚家族谷蛋白基因在相同的时间表达丰度不同;除GluB-1和GluB-4在H1中的表达峰值高于AJNT-4x和AJNT-2x,其他7个谷蛋白基因在H1中的表达峰值均远远低于AJNT-4x和AJNT-2x,差异显著;AJNT-4x的9个谷蛋白基因在花后30 d表达量均最高。上述结果为多倍体水稻优质育种提供理论依据。

【目的】克隆内蒙古白绒山羊AKT基因cDNA并分析其基本表达模式。【方法】RT-PCR克隆AKT基因cDNA。通过在线软件BLAST进行核酸序列分析,用SMART与Psite进行氨基酸序列分析。半定量RT-PCR检测AKT基因在绒山羊组织中的表达特异性。Western blotting检测绒山羊胎儿成纤维细胞中AKT表达。【结果】克隆到的内蒙古白绒山羊AKT基因cDNA片段长1 443 bp,包含了编码480个氨基酸残基的全长ORF,氨基酸序列与绵羊(NM_001161857.1)同源性为97%。SMART分析表明,ORF编码的蛋白包含了可与3-磷酸肌醇结合的PH结构域及具有丝氨酸/苏氨酸激酶...

腺苷三磷酸结合盒转运蛋白(ATP binding cassette transporter， ABC transporter)家族是最古老的膜蛋白家族之一，广泛存在于原核生物和真核生物体内，利用ATP水解释放的能量对氨基酸、脂质、抗生素等物质进行跨膜运输，参与生物体内多种生理活动。目前，对软体动物ABC转运蛋白家族的鉴定，仅在虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)、栉孔扇贝(Chlamys farreri)和长牡蛎(Crassostrea gigas) 3种双壳类中有系统研究，对缢蛏(Sinonovacula constricta) ABC转运蛋白家族的鉴定和表达模式分析尚未见报道。利用缢蛏基因组和转录组数据，运用本地及NCBI在线BLAST程序、FGENESH+、SMART、ExPASy、MEGA X、Mev 4.90和MapInspect等生物信息学分析工具，在全基因组水平系统地鉴定出52个缢蛏ABC转运蛋白，并对转运蛋白基因外显子数目、染色体定位等信息进行分析；通过系统进化分析，将缢蛏ABC转运蛋白家族分为8个亚家族，即ABCA～ABCH；通过比较分析不同物种ABC转运蛋白家族，推测基因串联复制事件对软体动物ABC转运蛋白家族成员数目的增加有影响。ABC转运蛋白基因在缢蛏不同发育时期和组织的表达分析显示，ABCC和ABCG亚家族多个基因在缢蛏稚贝时期表达量达到最高值，ABC转运蛋白基因在鳃、肝胰腺与性腺中表达种类较多。软体动物作为第二大动物类群，目前仅有3个物种的ABC转运蛋白得到了系统分类，缢蛏ABC转运蛋白基因家族的系统鉴定与表达模式分析为研究软体动物ABC转运蛋白基因的进化和缢蛏ABC转运蛋白功能提供了基础资料。

以转OsPIN1a的基因水稻‘中花11’为材料,设置3个处理:适温处理(CK),昼夜温度为30℃/28℃;高温处理(TR1),昼夜温度为38℃/33℃;复合处理(TR2),昼夜温度为38℃/33℃,配以0.1 mmol/L HgCl_2处理,研究高温胁迫和水通道蛋白抑制剂(HgCl_2)对水稻花期生理特性、水通道蛋白基因表达、稻穗和剑叶相对含水量及淀粉粒发育的影响。结果表明:与适温处理相比,高温与HgCl_2胁迫均能降低稻穗和剑叶相对含水量,降低结实率和千粒质量,降低柱头上花粉粒数量及柱头和花粉粒的线粒体活性,抑制OsTIPs和OsPIPs家族多个基因的表达,使稻穗水分供给减少,导致胚乳淀粉粒发育不良,形成不规则圆球形,以高温与HgCl_2复合处理时影响最大。水通道蛋白基因家族表达受抑制后,加重了高温胁迫对水稻植株花期生长发育的伤害,致使花粉粒和柱头活性下降,导致结实率降低和籽粒充实不良。

根据转录组测序结果，结合ＲＴ–ＰＣＲ及ＲＡＣＥ技术，从水稻干尖线虫中克隆出翻译控制肿瘤蛋白（ＴｈＥ ＴＲＡｎｓｌＡＴｉｏｎＡｌｌｙ ＣｏｎＴＲｏｌｌＥｄ ＴｕｍｏＲ ＰＲｏＴＥｉｎ，ＴＣＴＰ）基因Ａｂ–ＴＣＴＰ。该基因序列全长８１０ ｂＰ，开放阅读框长度为５４６ ｂＰ，编码１８１个氨基酸，预测蛋白相对分子质量为２０ ９３０，等电点为４．６８；Ａｂ–ＴＣＴＰ蛋白属于稳定性蛋白，没有信号肽和跨膜区域，亚细胞定位于细胞核中；该蛋白功能区域的氨基酸序列较为保守，含有ＴＣＴＰ保守结构域，属于ＴＣＴＰ超家族（ＴＣＴＰ ｓｕＰＥＲｆＡｍｉｌｙ）。多序列比对分析结果表明，Ａｂ–ＴＣＴＰ蛋白与秀丽隐杆线虫ＴＣＴ．．．