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[期刊] 华北农学报
[作者]
魏进招 陈秋玲 裴忠有 孙守钧
采用农杆菌介导转化方法,将携带有GUS基因1301质粒转入日本晴水稻品种中,建立水稻T-DNA插入群体5 200个。研究表明:通过PCR和Southern Blot分析证明了再生植株为转基因植株;通过改进热不对称交错PCR(TAIL-PCR)方法,已成功地分离并测定了437个株系的侧翼序列;通过序列同源性分析表明,有147个序列只包含有载体序列,有214个序列中包含有与T-DNA右边界相邻的水稻基因组序列;通过水稻边界序列与网上水稻数据库中基因组序列比对,将3个突变体的T-DNA插入位点定位于水稻特定染色体上。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
乔枫 赵开军 耿贵工 陈志
采用PCR-walking方法对水稻抗白叶枯病突变体G48的侧翼序列进行分析。通过特异性嵌套引物扩增和序列比对分析获得了该突变体T-DNA左、右边界侧翼序列,确定T-DNA插入水稻日本晴第三染色体clone OSJNBa0076E06(AC132215.1)位点上,左、右边界插入位点分别位于该克隆的第93 750、93 824碱基处。PCR-walking方法为T-DNA的侧翼序列分析提供了一种简单、高效的方法。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
黄磊 俞咪娜 胡建坤 于俊杰 尹小乐 聂亚锋 陈志谊 刘永锋
【目的】分析稻曲病菌T-DNA插入突变体库中致病力减弱突变菌株B-726的生物学性状,分析其T-DNA插入位点的侧翼序列,克隆因外源基因插入被破坏正常表达的基因,为明确该基因在稻曲病菌致病过程中的作用奠定基础,并为稻曲病防治新途径的制定提供理论依据。【方法】通过测定突变菌株B-726生长速率、产孢能力及致病力检测,分析其生物学性状;Southern杂交分析B-726外源基因插入的拷贝数;利用HiTail-PCR获得T-DNA插入位点的侧翼序列;运用RACE-PCR技术,克隆与插入位点毗邻的基因全长;用半定量RT-PCR分析该基因表达情况。【结果】突变菌株B-726与野生菌株P1相比致病力极显著...
[期刊] 华北农学报
[作者]
李子芳 宋东颖 张红影 裴忠有
为了给水稻功能基因组学研究提供材料,利用农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导转化法转化水稻品种日本晴(Oryza sative L. ssp. japonica cv. Nipponbare),共建立了1 833株独立的水稻T-DNA插入群体。T0通过PCR、GUS染色和Southern blot分析证明了再生植株为转基因植株。随机选取种植T1种子20粒,进行突变体筛选。通过对各个时期表型的观察和接种试验,共发现突变体208个,突变率为11.3%,表型涉及株高、叶片、穗型、生育期、颖花、颖壳着色、抗病性等。这些突变体不仅创造了具有优良农艺性状的水稻育种材料,为水稻育种...
关键词：
水稻 T-DNA 插入突变 转基因
[期刊] 中国农业科学
[作者]
徐荣旗 汪佳妮 陈捷胤 戴小枫
【目的】为鉴定棉花黄萎病菌随机插入突变体的表型特征,构建黄萎病菌遗传转化和功能基因研究的技术平台。【方法】采用农杆菌介导的T-DNA插入和高效TAIL-PCR方法。【结果】获得了2628个棉花黄萎病菌VD991的T-DNA随机插入的突变体和15个突变体插入位点的侧翼序列。部分突变体的表型特征和插入位点侧翼序列分析表明,①突变体的菌落形态分为菌丝型、菌核型和中间型3类,菌核型约占7.3%;②在摇瓶培养条件下,突变体产孢高峰在接种后第5—6天,菌核型突变体的产孢能力普遍高于菌丝型;③棉花黄萎病菌VD991可以产生胞外蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和果胶酶。筛选获得蛋白酶分泌缺失的突变体3个,淀粉酶分泌缺...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
俞咪娜 胡建坤 黄磊 于俊杰 尹小乐 聂亚锋 陈志谊 刘永锋
【目的】研究稻曲病菌致病力增强的ATMT突变菌株5062,为稻曲病菌致病机制解析、致病相关基因克隆提供方法基础。【方法】测定和观察5062的菌落直径、菌落形态、产孢能力等生物学特性,进一步利用TAIL-PCR和RACE技术克隆5062基因组的T-DNA侧翼基因,并比对分析基因的信息,最后利用RT-PCR检测突变基因的表达量。【结果】与野生型菌株相比,突变菌株5062田间接种表现为致病力增强,在MM和水琼脂培养基上生长速率减慢,产生大量分生孢子,而在PSA和TB3培养基上,其菌落形态、色素等方面与野生型无明显差异。TAIL-PCR扩增得到的紧邻T-DNA两侧的侧翼序列在野生型中不相邻。TAIL-...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
魏艺聪 潘初沂 李宏宇 鲁国东 雷财林 王宗华
为揭示稻瘟菌致病分子机制,创建了该菌T-DNA插入突变体库．部分突变体经表型分析,获得3个生长发育及致病性同时发生变异,5个生长发育正常但致病性变异及2个生长发育变异但致病性正常的突变体；以TAIL-PCR方法获得了这些突变体T-DNA插入位点及其边界序列,并用生物信息方法对被T-DNA标签的基因进行了分析,为进一步研究这些基因的功能提供了重要信息．
关键词：
稻瘟菌 T-DNA插入变异 生物信息
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
裴荣 陆展华 姚家玲
针对花器官形态和种子发育突变表型对大型水稻T-DNA插入突变体库进行筛选,获得了大量突变体信息及材料,在9 760个突变体家系中筛选得到177个花器官形态和数量异常的突变家系,突变频率为1.81%;对9 760个家系中的3 432个家系筛选得到179个种子发育缺陷的突变家系,突变频率为5.22%。对所获得的270个突变家系进行了T-DNA插入的阳性检测,阳性率为64.8%。利用公共数据库RMD(Rice MutantDatabase,RMD)给定的侧翼序列,鉴定了其中1个结实率较低的突变体家系,表明其突变表型和T-DNA插入共分离,为深入研究该基因的功能提供了重要的遗传材料。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
马雪萌 余成敏 赛小玲 刘贞 桑海洋 崔百明
【目的】建立一种批量分析T-DNA插入位点的简单、有效的方法。【方法】提供一种基于高通量测序技术的T-DNA插入位点的分析方法，将其命名为PSORA:Parallel sequencing of one round amplicons。首先对一轮交错式热不对称PCR(TAIL-PCR)的扩增产物进行高通量测序，随后通过生物信息学分析T-DNA插入位点，该方法降低了TAIL-PCR过程中对特异性扩增的要求。PSORA中使用的引物一侧为简并引物，另一侧为T-DNA特异性引物。在特异性引物的5’端设计6 nt的样品标签（Barcode），用于标记不同的转化事件。所使用的5个转基因烟草株系（L1、L6、L9、L15和L19）由农杆菌介导质粒pBI121转化获得。此外，通过标准PCR对PSORA的结果进行验证。【结果】利用PSORA对5个转基因株系的T-DNA插入位点进行分析，结果显示，L6含2个插入位点（NW＿015801367的36 316 bp处和NW＿015950898的42 202 bp处），L9、L15和L19各含1个插入位点（L9的插入位点为NW＿015943682的235 969 bp处；L15的插入位点为NW＿015802951的60 529 bp处；L19的插入位点为NW＿015863435的12 188 bp处），L1的插入位点未能成功获取。对生物信息学分析结果进行PCR验证，含不同插入位点的转基因株系之间可互为阴性对照，野生型（WT）作为空白对照，结果表明，在各转基因株系中均得到与预期一致的特异性扩增，该结果验证了PSORA的有效性。【结论】PSORA是一种分析T-DNA插入位点的有效方法，可以同时分析多个插入事件，相对于传统的染色体步移方法更简便、快速。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
于俊杰 聂亚锋 俞咪娜 尹小乐 胡建坤 黄磊 陈志谊 刘永锋
【目的】克隆稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)分生孢子高产突变菌株A2588的T-DNA插入突变基因,解析该基因在稻曲病菌分生孢子形成中的功能,为进一步揭示稻曲病菌的分生孢子形成机制提供理论基础。【方法】测定A2588的产分生孢子能力、孢子萌发率、菌丝直线生长能力和热敏感性等生物学特性,利用hiTAIL-PCR、RACE和半定量PCR等方法克隆T-DNA插入突变基因,并结合生物信息学方法分析T-DNA插入导致分生孢子产量提高的分子机理。【结果】与稻曲病菌野生型菌株70-22相比,突变菌株A2588在PS培养液中产生数量为10倍以上的分生孢子,在MM培养液中产生数量约20倍的...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
刘辉 赵竹青
通过温室水培试验对根癌农杆菌介导的T-DNA随机插入构建的水稻突变体库的T1代2 173个家系进行筛选。以叶绿素SPAD值为指标,以苗期表观症状为参考指标,筛选到27个氮营养缺失的突变家系。对27个突变家系进行遗传分析、复筛及T2代鉴定,结果表明,编号955家系为氮营养缺陷型突变家系,且T2代能够稳定遗传。该材料通过进一步鉴定可用于分离、鉴定氮营养相关基因。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
刘辉 赵竹青 叶志娟 杨野
利用营养液培养试验,研究水稻T-DNA插入氮营养缺陷型突变体的氮营养特性。结果表明,氮营养缺陷型突变体突变植株硝态氮和铵态氮吸收速率均低于原始亲本,植株氮含量及硝酸还原酶活性降低,氮同化能力下降,根系变短,根系体积及根系活跃面积变小,植株变矮。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
程馨妍 裴荣 姚家玲
采用石蜡切片法对水稻OsEMF2b的T-DNA插入杂合突变体的花器官形态、雌雄蕊发育和种子形成等过程进行了细胞学研究。结果表明,OsEMF2b杂合突变体花器官形态和各部分的数量有变异,但花药和胚珠发育以及花粉和胚囊的育性正常。OsEMF2b杂合突变体出现一定比例的受精卵不分裂、胚胎发育延迟、胚胎畸形,胚乳游离核不能细胞化和胚乳细胞退化解体等异常现象,从而导致其结实率明显低于野生型。OsEMF2b基因可能在水稻的花器官形成和种子发育过程中具有重要的调控作用。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
李蕾 李季 孟永娇 张璐 娄群峰 钱春桃 陈劲枫
［目的］为了进一步研究黄瓜基因的功能，本文构建了黄瓜Ｔ－ＤＮＡ插入突变体库。［方法］以黄瓜栽培品种‘长春密刺’子叶节为转化外植体，通过农杆菌介导的遗传转化方法，将Ｔ－ＤＮＡ插入突变载体ｐＲＯＫ２后转化黄瓜；通过筛选压力梯度试验，确定遗传转化体系最适合的卡那霉素（ＫＡＮ）筛选浓度；使用ｐＣＲ检测和斑点杂交方法鉴定Ｔ０和Ｔ１代转化植株；以‘长春密刺’植株为对照，统计Ｔ１代植株表型。［结果］确定１００ ｍｇ·Ｌ－１为最适合的ＫＡＮ抗性芽筛选浓度。Ｔ０代植株ｐＣＲ检测结果初步证明，ｐＲＯＫ２成功整合到１４Ｓ１和１４Ｓ２两个Ｔ０代株系基因组中。１４Ｓ１自交后获得５５个Ｔ１代单株，对其进行ｐＣＲ检测，发现．．．
[期刊] 华北农学报
[作者]
仪治本 梁小红
突变体在水稻功能基因组研究中具有重要的作用。对水稻OsFCA位点的插入突变体进行了分子鉴定,证实此突变体为纯合突变体,并且发现突变体与野生型植株相比,抽穗期明显延迟。通过RT-PCR结果分析表明,T-DNA插入的突变体植株中OsFCA基因完全不表达。另外,在短日照条件下,对水稻成花相关的2个重要基因Hd1和Hd3a的RT-PCR分析表明,在野生型植株中,2个基因的表达量都明显高于突变体植株,尤其是在夜间的表达量相差较为明显。说明OsFCA在短日照条件下通过正向调控Hd1和Hd3a的表达促进水稻的开花。
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