CCHC型锌指结构蛋白Os ZFP参与调控水稻Oryza sativa侧根的生长发育,但其相关互作蛋白及调控机制未知。以水稻‘日本晴’‘Nipponbare’为试验材料,克隆了Os ZFP基因,利用Eco RI和Sal I酶切位点构建酵母双杂交钓饵表达载体p GBKT7+Os ZFP,验证该表达载体对酵母菌株Y2H无毒性及报告基因自激活现象;采用酵母双杂交技术,从已构建的水稻c DNA文库中筛选到1个阳性互作蛋白,经美国国家生物技术信息中心数据库(NCBI)同源性比对,鉴定为含有T-complex pol

【目的】利用酵母双杂交系统，以组成抗稻瘟病基因Ｐｉｋ－ｈ的２个紧密连锁且功能独立的Ｐｉｋｈ－１和Ｐｉｋｈ－２蛋白为诱饵，在水稻叶片中筛选与之互作的蛋白，以便深入研究抗病基因Ｐｉｋ－ｈ介导的抗病反应途径。【方法】以含抗稻瘟病基因Ｐｉｋ－ｈ的近等基因系ｉＲＢＬ８为材料，取稻瘟病菌（ＭａｇｎａＰｏＲｔｈｅ ｏＲｙｚａｅ）ｇＤ０１９３接种１２和２４ ｈ后的水稻叶片，等量混合后提取总Ｒｎａ，按照酵母双杂交试剂盒（Ｍａｋｅ ｙｏｕＲ ｏｗｎ＂Ｍａｔｅ＆ＰＬａｔｅ＂ＬｉＢＲａＲｙ ＳｙＳｔｅＭ）的要求构建水稻叶片靶标ｃ Ｄｎａ文库。利用快速重组克隆的方法构建Ｐ ｇＢｋｔ７－Ｐｉｋｈ１和Ｐ ｇＢｋｔ７－Ｐｉｋ．．．

[目的]本文旨在揭示General control non-repressible 5 (GCN5)在葡萄生长发育过程中的调控机制，并筛选出与VvGCN5互作的蛋白，以期为进一步构建VvGCN5在葡萄生长发育中的调控网络提供理论基础。[方法]利用生物信息学技术对VvGCN5的蛋白二级结构、基因结构、功能域、启动子的顺式作用元件以及抗逆的表达量和时空表达进行分析。并在烟草中进行亚细胞定位，研究VvGCN5表达位置。通过酵母双杂技术筛选与VvGCN5互作的蛋白，并通过BIFC进行验证。[结果] VvGCN5的二级结构由α-螺旋、延伸链、β-折叠以及无规则卷曲构成，含有10段内含子序列和11段CDS序列，拥有Acetyltransf＿1和Bromodomain结构域，以及ARE、GT1-motif、TGACG-motif、CAT-box、CGTCA-motif等顺式作用元件。通过查询GEO数据库发现VvGCN5可能受到光照和霜霉病的影响。VvGCN5主要表达于葡萄的成熟茎、萌芽初期、心皮、种子中。亚细胞定位发现VvGCN5位于细胞核和细胞膜上。此外，以pGBKT7-VvGCN5作为诱饵蛋白，通过酵母双杂交技术和双分子荧光互补技术发现了8个阳性蛋白与VvGCN5互作。[结论]本研究鉴定并分析了VvGCN5的基本信息，并得到了8个与VvGCN5互作的蛋白。

为了进一步挖掘拟南芥LBD逆境胁迫响应基因在植物非生物逆境胁迫应答中的作用,探究拟南芥逆境胁迫响应机理,将前期筛选到的LBD15基因构建到pGBKT7酵母表达载体上,筛选与LBD15互作的蛋白。利用酵母双杂交技术筛选了拟南芥全长均一化的酵母文库,在本次筛库试验中,146个样有107个测出序列,通过NCBI Blast分析,其中有96个获得了基因号,占总数的87.9%。根据基因号进行分类,得到了48个蛋白,在筛选到的48个蛋白中有59%的蛋白都是有重复的。然后把基因号通过网站TAIR(www.arabidopsis.org/index.jsp)查找其蛋白序列,通过亚细胞定位预测网站(http://cello.life.nctu.edu.tw/)分析其亚细胞定位,定位分析结果表明,这些蛋白主要定位于叶绿体、细胞质和细胞核。利用Blast2GO进行Gene Ontology注释显示互作蛋白共参与了14个生物过程,包括细胞过程、代谢过程、刺激响应、生物过程的调控、单组织和多组织过程及发育进程调控等。对得到的可能互作蛋白随机挑选了5个进行了互作蛋白的分离和回复验证,结果发现,AP19蛋白及其他一些蛋白的菌落能够在营养缺陷型的平板上正常生长,进一步证实了其为互作蛋白。酵母双杂交文库的成功筛选为进一步研究拟南芥LBD15的分子作用机制奠定了基础。

[目的]本文旨在揭示组蛋白乙酰转移酶GCN5(general control non-repressible 5)在葡萄生长发育过程中的调控机制，并筛选出与VvGCN5互作的蛋白，以期为进一步构建VvGCN5在葡萄生长发育中的调控网络提供理论基础。[方法]利用生物信息学技术对VvGCN5的蛋白二级结构、基因结构、功能域、启动子的顺式作用元件以及抗逆的表达量和时空表达进行分析，并在烟草中进行亚细胞定位，研究VvGCN5表达位置。通过酵母双杂交技术筛选与VvGCN5互作的蛋白，并通过双分子荧光互补(BIFC)技术进行验证。[结果]VvGCN5的二级结构由α-螺旋、延伸链、β-折叠以及无规则卷曲构成，含有10段内含子序列和11段CDS序列，具有Acetyltransf＿1和Bromodomain结构域，以及ARE、GT1-motif、TGACG-motif、CAT-box、CGTCA-motif等顺式作用元件。通过查询GEO数据库发现VvGCN5可能受到光照和灰霉病的影响。VvGCN5主要表达于葡萄的成熟茎、萌芽初期、心皮、种子中。亚细胞定位发现VvGCN5位于细胞核和细胞膜上。此外，以pGBKT7-VvGCN5作为诱饵蛋白，通过酵母双杂交技术和双分子荧光互补技术发现8个阳性蛋白与VvGCN5互作。[结论]本研究鉴定并分析了VvGCN5的基本信息，并得到了8个与VvGCN5互作的蛋白。

利用酵母双杂交系统,以稻瘟病菌MoYpt7激活型为诱饵蛋白,从稻瘟病菌不同生长发育阶段的cDNA文库中筛选互作蛋白,经复筛得到10个候选互作蛋白基因,利用Bi FC或pull-down assay验证蛋白间的互作,为寻找MoYpt7下游调控侵染致病过程的效应因子提供依据.

[目的]本文旨在探究水稻抽穗期基因OsFKF1感受蓝光并调控抽穗期的分子机制。[方法]以‘宁粳2号’及其晚抽穗突变体lhn2，lhn3为材料，分析野生型和突变体的农艺性状。利用MutMap的方法定位并克隆导致lhn2、lhn3突变的基因。为研究候选基因OsFKF1的功能，观察水稻原生质体中OsFKF1的亚细胞定位。利用不同波长的光源处理检测OsFKF1对Ehd1表达的影响。通过酵母文库筛选实验寻找与OsFKF1互作的蛋白，并利用荧光素酶互补等实验进行验证。[结果]在南京自然长日照条件下lhn2、lhn3突变体抽穗期较野生型均延迟26 d左右，株高、粒长、粒宽、千粒重均显著下降。MutMap分析结果表明导致lhn2、lhn3突变的基因均为水稻抽穗期基因OsFKF1。亚细胞定位结果显示OsFKF1在水稻原生质体中定位于细胞质和细胞核内。OsFKF1仅在蓝光下诱导Ehd1表达，且蓝光处理3 h达到峰值。利用酵母文库筛选实验筛到与OsFKF1互作的一个含有泛素结合相关结构域的蛋白HGW，并利用荧光素酶互补等实验证实了OsFKF1与HGW的互作。[结论]蓝光诱导Ehd1的表达部分依赖于OsFKF1。推测OsFKF1和HGW可能形成复合体通过泛素化降解蛋白途径调控水稻抽穗。

[目的]本文旨在探究水稻抽穗期基因OsFKF1感受蓝光并调控抽穗期的分子机制。[方法]以‘宁粳2号’及其晚抽穗突变体lhn2，lhn3为材料，分析野生型和突变体的农艺性状。利用MutMap的方法定位并克隆导致lhn2、lhn3突变的基因。为研究候选基因OsFKF1的功能，观察水稻原生质体中OsFKF1的亚细胞定位。利用不同波长的光源处理检测OsFKF1对Ehd1表达的影响。通过酵母文库筛选实验寻找与OsFKF1互作的蛋白，并利用荧光素酶互补等实验进行验证。[结果]在南京自然长日照条件下lhn2、lhn3突变体抽穗期较野生型均延迟26 d左右，株高、粒长、粒宽、千粒重均显著下降。MutMap分析结果表明导致lhn2、lhn3突变的基因均为水稻抽穗期基因OsFKF1。亚细胞定位结果显示OsFKF1在水稻原生质体中定位于细胞质和细胞核内。OsFKF1仅在蓝光下诱导Ehd1表达，且蓝光处理3 h达到峰值。利用酵母文库筛选实验筛到与OsFKF1互作的一个含有泛素结合相关结构域的蛋白HGW，并利用荧光素酶互补等实验证实了OsFKF1与HGW的互作。[结论]蓝光诱导Ehd1的表达部分依赖于OsFKF1。推测OsFKF1和HGW可能形成复合体通过泛素化降解蛋白途径调控水稻抽穗。

【目的】籽粒灌浆对水稻产量及品质的形成至关重要。14-3-3蛋白是一种信号转导调节因子,在植物生长发育中发挥着重要调控作用。本研究通过分析14-3-3蛋白家族在籽粒灌浆过程中的基因表达模式及其互作靶蛋白,从而揭示其在籽粒灌浆过程中的功能。【方法】利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析水稻14-3-3基因家族在籽粒灌浆过程中的表达变化模式,并从中选取GF14b及GF14e进行后续的蛋白功能分析。利用KEGG数据库对GF14b及GF14e蛋白功能motif位点进行分析;构建GST-GF14b及GST-GF14e表达载体,利用亲和层析技术分别钓取籽粒中与GF14b及GF14e互作的靶蛋白,并借助LC-MS/MS对靶蛋白进行鉴定。采用GST pull-down方法验证靶蛋白与GF14b及GF14e间的蛋白互作关系。利用Kinasephos在线程序对靶蛋白的Ser和Thr磷酸化位点进行预测;采用MapMan 3.6.0软件对靶蛋白的功能及参与的代谢过程进行分析。在籽粒灌浆期(花后15 d),分别喷施25×10-6 mol·L-1 ABA,10×10-6 mol·L-1 IAA,100×10-6 mol·L-1 GA,50×10-6 mol·L-1 ZR和2×10-4 mol·L-1 BR,研究外源激素处理对籽粒灌浆过程中GF14b,GF14e及其互作靶基因表达的影响。【结果】14-3-3家族基因中,除GF14h外,其余7个家族成员在水稻籽粒中均有表达,其中GF14b及GF14e在籽粒灌浆过程中的表达水平较高且变化幅度较大。通过蛋白序列分析发现,GF14b与GF14e间具有3个相同,2个差异的motif功能位点。通过亲和层析试验,在籽粒中共鉴定到59个与GF14b和72个与GF14e互作的靶蛋白,其中有43个靶蛋白与2个成员均有互作,分别有16个和29个靶蛋白与GF14b和GF14e特异结合。随机选取2个靶蛋白进行体外蛋白互作验证,结果表明靶蛋白SUS3与GF14b和GF14e均存在互作关系,而靶蛋白PSA仅与GF14e有相互作用关系,验证了亲和层析结果的准确性。蛋白功能的分析表明,GF14b和GF14e通过与靶蛋白的结合,共同参与了籽粒灌浆过程中蔗糖转化、淀粉合成、糖酵解、TCA循环等碳代谢途径。同时,GF14b及GF14e还具有特异的调控功能,其中GF14b与核酸代谢及物质转运密切相关,而GF14e与C1代谢中的关键蛋白存在互作。此外,大部分靶蛋白均鉴定到具有潜在的Ser和Thr磷酸化位点。外源激素处理下,籽粒中GF14b和GF14e上调表达,而与淀粉合成代谢相关的靶基因(SUS2、 AGPS、AGPL、PPDK2、SBE)大部分呈下调表达的趋势。【结论】14-3-3基因家族成员GF14b和GF14e在水稻籽粒灌浆过程中的表达变化幅度较大,且会响应激素浓度的改变,并通过蛋白互作的形式负调控淀粉合成代谢相关基因的表达,从而对水稻籽粒淀粉的合成起到重要的调控作用。

【目的】筛选介体灰飞虱(Laodelphax striatellus,SBPH)中与水稻条纹病毒(RSV)病害特异蛋白(disease-specific protein,SP)可能发生相互作用的蛋白质,为明确介体灰飞虱传播RSV的分子机制及SP在传毒过程中的作用打下基础。【方法】提取高质量灰飞虱总RNA并通过TaKaRa D9086 OligtexTM-dT30 mRNA Purification Kit对mRNA进行纯化。利用SMART技术合成双链cDNA,利用Axygen的PCR纯化回收试剂盒将ds cDNA回收纯化,纯化后的ds cDNA再经SfiⅠ限制性内切酶处理纯化后与文库载体pPR...

【目的】细胞凋亡作为昆虫免疫应答的重要组成部分,在病毒与宿主相互作用的过程中扮演着重要角色,以细胞凋亡相关基因为研究对象对阐明其在病毒感染过程中的作用具有重要的参考价值。本研究旨在筛选家蚕凋亡抑制蛋白(Bombyx mori inhibitor of apoptosis protein,BmIAP)的相互作用蛋白,并验证其在家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV)侵染过程中与Bmiap的相互调控关系及在BmNPV增殖过程中的作用,为探明宿主与BmNPV相互作用的分子机制提供理论依据。【方法】利用免疫共沉淀技术筛选在BmNPV侵染家蚕细胞过程中与BmIAP相互作用的蛋白,对获得的特异性差异条带进行LC-MS/MS蛋白质谱分析,根据蛋白分子量大小并利用生物信息学方法对获得的蛋白进行鉴定,确定候选基因;通过分子克隆技术对候选基因进行克隆,利用SMART在线工具及BioEdit分别对候选基因的结构域进行预测及多序列比对分析;通过免疫荧光试验验证BmIAP和候选蛋白的细胞共定位情况,并进一步利用免疫共沉淀验证它们的相互作用;分别通过真核表达和基于CRISPR/Cas9的基因编辑系统对候选基因进行过表达和敲除,利用qRT-PCR技术检测相应基因的表达情况,以确定Bmiap和Bmpp5在BmNPV侵染过程中的调控关系;同样,在过表达和敲除Bmpp5后检测杆状病毒Vp39的表达量,以确定Bmpp5对BmNPV增殖的影响。【结果】通过免疫共沉淀获得7个可能与BmIAP相互作用的宿主蛋白和1个BmNPV蛋白,进一步分析确定1个与凋亡相关的候选基因Bmpp5;Bmpp5的开放阅读框为1 473 bp,编码490个氨基酸,预测的蛋白分子量约为56 kD,含3个TRP结构域和1个PP2Ac结构域,在昆虫间具有较高的保守性;免疫荧光检测证明BmIAP和BmPP5共定位于细胞质中,免疫共沉淀结果表明两者可以相互作用;在BmNPV侵染过程中,过表达Bmiap后,Bmpp5的表达量显著上调,而敲除Bmiap后,Bmpp5的表达量显著下调,表明Bmiap能够促进Bmpp5的表达;同时,过表达Bmpp5后,Bmiap显著上调表达,而敲除Bmpp5后,Bmiap显著下调表达,表明Bmpp5同样能够促进Bmiap的表达;过表达Bmpp5能够促进BmNPV的增殖,敲除Bmpp5能够抑制BmNPV的增殖,表明Bmpp5的表达利于BmNPV的增殖。【结论】鉴定了1个能够与BmIAP相互作用的蛋白BmPP5,且该蛋白在昆虫中高度保守;在BmNPV侵染过程中,Bmiap和Bmpp5能够相互促进,且Bmpp5能够促进BmNPV的复制增殖。

采用PCR扩增菊花B病毒(CVB)外壳蛋白基因的开放阅读框,构建酵母双杂交系统所需的诱饵表达载体pGBKT7-CVBCP,测序验证后转化Y2HGold酵母菌。将酵母菌Y187/pGADT7-cDNA与酵母菌Y2HGold/pGBKT7-CVBCP进行交配转化,在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal平板上筛选蓝色阳性克隆并测序pGADT7-cDNA的插入片段。结果表明:诱饵载体表达产物对酵母无毒性作用,且对报告基因无自激活作用。筛选菊花cDNA文库初步得到了与CVB外壳蛋白相互作用的E3泛素连接酶ARIADNE-like蛋白和ATP结合蛋白,为进一步研究CVB外壳蛋白与寄...

【目的】筛选长足大竹象(Cyrtotrachelus buqueti)信息素结合蛋白CbuqPBP2的互作蛋白,为实现利用信息物质对长足大竹象种群持续控制提供参考。【方法】利用GST pull-down联合质谱技术,对长足大竹象信息素结合蛋白CbuqPBP2的互作蛋白进行筛选、鉴定和分析,并采用酵母双杂交试验验证了CbuqPBP2与信息素结合蛋白CbuqPBP1的特异性互作。【结果】GST pull-down共筛选出45个与长足大竹象信息素结合蛋白CbuqPBP2特异性结合的候选互作蛋白,包括CbuqPBP1、ND2、CYTB。这些互作蛋白主要参与细胞过程、定位、代谢过程、应激反应以及生物调控等多个生物学过程。使用酵母双杂交体系,构建了pGADT7-PBP1重组猎物质粒与pGBKT7-PBP2重组诱饵质粒,通过诱饵质粒毒性检测和自激活检测,表明重组诱饵质粒对Y2HGold酵母菌无毒性作用。共转化验证结果显示,诱饵质粒pGBKT7-PBP2共转化酵母菌株能够在TDO培养基上生长。【结论】CbuqPBP2和Cbuq PBP1之间有相互作用,不同信息素结合蛋白间的互作对深入理解长足大竹象嗅觉感受机制提供了新的思路。

【目的】利用构建的干旱胁迫处理的小麦cDNA文库,通过酵母双杂系统筛选与小麦TaMAPK2互作的蛋白,并对其进行验证分析。【方法】以小麦cDNA为模板克隆得到TaMAPK2,构建pGBKT7-TaMAPK2诱饵载体,将诱饵载体pGBKT7-TaMAPK2质粒以及pGADT7和小麦cDNA文库共转化酵母AH109菌株感受态细胞,在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade营养缺陷型培养基上30℃培养3—5 d,挑选单克隆于YPDA培养基中培养,吸取1μL各候选克隆的菌液点至于SD/Raf/Gal/x-gal平板上培养,筛选蓝色单克隆。将筛出的单克隆经测序、序列比对分析,初步获得与TaMAPK2...

【目的】从葡萄中克隆细胞分裂素响应调节因子ＶＶＲＲ２，获得ＶＶＲＲ２的互作蛋白，为阐明ＶＶＲＲ２在欧洲葡萄抗病反应中的作用机制提供依据。【方法】对葡萄接种白粉病菌，提取总ＲＮＡ后反转录，利用实时荧光定量ＰＣＲ检测ＶＶＲＲ２转录本对白粉病菌的响应；构建瞬时表达载体Ｐ ＢＩ２２１－ＶＶＲＲ２－ＧＦＰ，转化拟南芥原生质体进行亚细胞定位分析；构建酵母表达载体Ｐ ＧＢＫＴ７－ＶＶＲＲ２，转化酵母菌株ＡＨ１０９，检测ＶＶＲＲ２的转录激活活性；构建酵母表达Ｃ ＤＮＡ文库，以ＶＶＲＲ２为诱饵，通过ＭＡＴＩＮＧ法筛选互作蛋白，对获得候选序列进行ＢｌＡｓＴ分析；将候选蛋白ＶＶＴＧＡ的全长序列克隆至Ｐ ＧＡＤＴ７载．．．