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[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
鲁玉柱 封振 边黎颖 梁建生
【目的】microRNA是一类长度为21~23 nt的非编码小分子RNA,对动植物的正常发育具有非常重要的调节作用。水稻Os-miR390的功能可能与生长素应答相关,拟采用转基因方法研究其生物学功能。【方法】根据水稻Os-miR390的前体RNA结构特点合理设计引物,从水稻基因组中克隆出其前体DNA片段,将其构建在玉米UbiI启动子驱动的表达载体中,并转入水稻。【结果】利用PCR成功地从水稻基因组中扩增出了Os-miR390前体基因,并将其构建在UbiI水稻组成型启动子下。经农杆菌介导,将其成功转入水稻愈伤,获得抗性幼苗,经过PCR检测,得到阳性转基因植株。【结论】T0代转基因植株表现叶片黄化...
[期刊] 华北农学报
[作者]
孙琦 刘香玲 张宁 余柏胜
水稻苗期冷害是导致水稻减产的重要因素之一。为了发掘新的耐冷基因、诠释其耐冷分子机制并应用分子育种的手段提高水稻苗期耐冷性,前期已通过Northern表达分析,从已构建的水稻苗期低温诱导表达正向抑制差减cDNA文库中,发现了一个受低温诱导上调表达的功能未知的C2H2型锌指结构域蛋白新基因(特命名为OsCOI)。本研究进一步通过RT-PCR的方法从水稻中克隆了该基因,构建了其植物过表达载体,并通过农杆菌介导转入水稻基因组中,获得了其过表达转基因水稻株系,为进一步研究该基因的功能并探讨其在水稻耐冷分子育种中的应用价值奠定了基础。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
张芸 李会 车丽玲 黄思齐 邱承祥 杨志敏
MicroRNAs(miRNAs)是一类内源性长度约为21～24个核苷酸,在基因表达、生长发育、细胞周期及环境胁迫等方面起着重要作用的单链非编码小分子RNA。研究表明:植物miRNAs通过转录后以切割的方式对其靶基因的表达起着负调控作用。miR395的靶基因分别为ATP硫酸化酶和硫转运体SULTR2;1,两者在硫同化及转运中起着重要的作用。为了进一步探究miR395的功能,本研究利用PCR法从拟南芥中克隆了miR395d前体基因,并与pCAMBIA1304载体连接,构建了miR395d前体基因的过量表达载体,通过根癌农杆菌介导法将其转化到甘蓝型油菜特选4号中,目前已获得了转基因植株。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
史奇奇 李增强 韦范 汤丹峰 贾瑞星 谢红英 周瑞阳 陈鹏
为探明miRNA在红麻中的功能,以红麻基因组DNA为模板,根据红麻microRNA(miRNA)高通量测序数据结果,克隆红麻miR394前体基因序列,并构建CRISPR/Cas9载体。结果表明红麻miR394前体基因序列大小为175bp,用Mfold在线软件分析,其前体序列能形成稳定的二级结构。根据红麻miR394前体基因序列,设计合适的CRISPR/Cas9靶标序列,利用改良的CRISPR/Cas9多靶点载体系统,以AtU3b和AtU6-29质粒为模板,使用Overlapping PCR法构建AtU3b-sgRNA和AtU6-29-sgRNA表达盒,使用Golden Gate Cloning方法成功把靶标AtU3b-sgRNA和AtU6-29-sgRNA表达盒构建到pYLCRISPR/Cas9载体中,并将构建好的载体命名为pCas9-miR394。分离红麻叶片原生质体,将pCas9-miR394载体转入红麻叶片原生质体中进行瞬时表达,测序结果表明:2个靶点Target site 1(T1)和Target site 2(T2)处都发生碱基突变,表明pCas9-miR394载体在红麻原生质体中具有靶向切割的活性。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
赵露 苑雪琪 李俊 杨雪梅 魏云洁 许永华
[目的]克隆白屈菜CmTLP基因并进行植物表达载体构建,为进一步研究CmTLP基因的功能及探索耐寒抗寒药用植物分子育种奠定基础。[方法]基于白屈菜转录组数据,分析得到白屈菜TLP基因开放阅读框,以18S RNA为内参基因,采用qRT-PCR法检测CmTLP基因在不同温度(20(CK),10,0,-7,-20℃)下白屈菜植株中的相对表达量。用RT-PCR法克隆该基因并构建植物表达载体,电击法转化根癌农杆菌。[结果]qRT-PCR结果表明,CmTLP基因在-7℃、12 h时,相对表达量最高;-7℃、24 h时,相对表达量最低。克隆白屈菜TLP基因,命名为CmTLP。该基因开放阅读框长度为696 bp,编码由231个氨基酸组成的肽链;分子质量为24.66 ku,为酸性蛋白。系统发育树表明,CmTLP基因与博落回、月季、胡桃的氨基酸序列有较高的同源性。构建了植物表达载体pRI201-AN-CmTLP,并成功转化根癌农杆菌。[结论]克隆了白屈菜CmTLP基因,构建植物表达载体pRI201-AN-CmTLP,并成功转化根癌农杆菌。
关键词：
白屈菜 植物表达载体 抗寒机理 类甜蛋白
[期刊] 华北农学报
[作者]
斯钦巴特尔 莫日根 哈斯阿古拉 张剑峰
以甜菜丛根病根或病叶总RNA为模板,经反转录PCR扩增合成编码BNYVV CP的全长cDNA,将其克隆于pUCm-T载体上,获得了重组质粒pUCm-T/CP。经序列分析,此cDNA为一个567 bp长的开放阅读框架,编码由188个氨基酸组成的病毒外壳蛋白。又将CP基因构建到植物双元载体pROKⅡ中。最后通过三亲融合,得到了融合农杆菌LB4404。
[期刊] 华北农学报
[作者]
田华 徐春霞 段美洋 黎国喜 唐湘如
利用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)得到在水稻中特异性表达的脯氨酸氧化酶(PRO)基因。DNA序列分析表明,所获得水稻的PROcDNA的最大开放阅读框序列全长为1 428 bp,可编码476个氨基酸。该序列与NCBI网站上已发表的PRO基因100%相似。为了能进一步验证所克隆的序列是我们所需的目的基因,成功构建了PRO基因超表达载体和PRO基因干涉载体,便于导入水稻中进行基因的功能鉴定。
关键词：
香稻 脯氨酸氧化酶 基因 克隆 表达载体
[期刊] 华北农学报
[作者]
王青云 王润青 方聪燕 侯佩 苏亮 李建平 宋梅芳 杨建平 李雪梅 吴大付
为克隆水稻蛋白磷酸酶6(PP6)催化亚基基因OsPP6C,并构建该基因的过表达载体以及进行生物信息学分析。采用RT-PCR技术从水稻中花11叶片cDNA中扩增OsPP6C基因全长,并构建与GUS融合的pBI121-OsPP6CGUS表达载体。通过生物信息学方法分析了OsPP6C蛋白的理化性质、与拟南芥AtPP6C(即AtFyPP)之间的同源性以及不同物种间的系统发育关系,此外,对OsPP6C基因的启动子进行了顺式作用元件分析。结果表明,该基因转录序列包含一个912 bp的开放阅读框,编码303个氨基酸残基,蛋白的分子量约为3.47 kDa,等电点为5.13;具有疏水性,但不存在信号肽,属于非分...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张文惠 张红心 樊圃 陈亮 山仑
采用RT-PCR技术克隆了水稻O-甲基转移酶ZRP 4基因的cDNA片段,并进行了序列测定与分析。结果表明,该序列全长1 101 bp,编码366个氨基酸,与G enB ank中水稻ZRP 4基因序列比对,核苷酸同源性为99.8%,氨基酸同源性为99.7%。将克隆片段插入中间载体pBPFΩ7,经H indⅢ酶切回收带有P 35s启动子和nos终止子片段,连接pCAM B IA 1301载体,成功构建ZRP 4基因的植物表达载体。
[期刊] 华北农学报
[作者]
王伟权 杨翠平 王景雪 梁超 刘莉
GluB-4是水稻种子谷蛋白的编码基因,在种子成熟过程中,由GluB-4启动子调控,在胚乳中特异地表达。以水稻基因组DNA为模板,通过PCR扩增技术得到GluB-4启动子片段,序列分析结果表明:获得的启动子片段的大小为1 560 bp,与已报道的该启动子序列相比较,其核苷酸序列同源性为99.8%。该启动子区域含有TATA-box,CAAT-box,GCN4基序,Skn-1基序等胚乳特异表达启动子所必需的正调控元件,同时还含有高水平转录调控因子5UTR Py-rich stretch序列。利用该启动子构建了植物种子特异表达载体pCGB4P,为进一步的研究工作奠定了基础。
关键词：
水稻 GluB-4基因 启动子 谷蛋白
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
姚新灵 万巧风 陈彬 李珺 丁海麦 狄建军 郭蔼光
为了研究不同启动子驱动的反义SAGP抑制内源ADP-Glc PPase小亚基编码基因表达的效果,创造适于外源基因表达的突变体,利用RT-PCR方法,由马铃薯块茎cDNA克隆获得ADP-Glc PPase小亚基编码基因(SAGP)的1 821 bp cDNA。核酸数据库检索和序列比对分析表明,已克隆的SAGP基因cDNA推测编码607个氨基酸组成的多肽,其中第312和411的天冬酰氨均突变为丝氨酸。以pCambia为基础,分别构建了CaMV35S和GBSSI块茎启动子驱动的小亚基cDNA反义结构植物表达载体。
[期刊] 华北农学报
[作者]
苏丽艳 李正国 樊晶 高雪 杨迎伍 邓伟 郝彦伟
从脐橙果皮褐变相关基因的cDNA抑制差减文库中,获得了一个CAB基因家族的同源EST序列,通过快速扩增cDNA末端(RACE)方法成功克隆得到984bp的CsCAB全长基因(GenBank登录号EF010854)。序列分析结果表明,CsCAB包含一个621bp的开放阅读框(ORF),编码207个氨基酸;CsCAB蛋白与钙结合蛋白具有很高的同源性,且具有钙结合蛋白的保守结构域EF-hand。并构建了脐橙CsCAB基因的正、反义植物表达载体pCAMBIA1301-CABs和pCAMBIA1301-CABas,为该基因的功能研究奠定了基础。
关键词：
脐橙 CsCAB 克隆 表达载体 构建
[期刊] 华北农学报
[作者]
杨英军 李亚蝉
首先提取苦瓜的基因组DNA,然后根据Genbank中已公开发表的MAP30序列,设计一对特异引物MAP301,MAP302,并增添特异定位于内质网的小肽Kozak序列。采用PCR技术,从苦瓜的基因组DNA中扩增出一分子量为800bp左右的片段,回收克隆测序,结果表明,克隆获得片段与已公开发表的MAP30序列同源性达100%,将阳性克隆进行酶切,获得的目标片段与用同样酶切所获得的植物表达载体pEV1和pEV2大片段连接,酶切鉴定重组子构建成特异表达于果实的载体。
关键词：
苦瓜 MAP30 载体构建 PCR
[期刊] 华北农学报
[作者]
任磊 王雁 周琳 彭镇华
以牡丹品种赵粉为试材,采用RT-PCR和RACE方法从雄蕊中获得了一个牡丹苹果酸脱氢酶基因cDNA全长,命名为PsMDH,GenBank登录号为HQ449567。其cDNA全长1 283 bp,包含80 bp的5'非编码区、203 bp的3'非编码区和一个长度为999 bp编码332个氨基酸的开放阅读框。序列比对和系统进化分析表明,PsMDH与毛果杨的亲缘关系最近,相似性达93.37%以上。相对荧光定量PCR分析表明,PsMDH在心皮中的表达量最高,在雄蕊中表达量最低。成功构建植物表达载体,为牡丹品种改良提供基础。
[期刊] 华北农学报
[作者]
苑博华 蒋继志 刘红梅
分别以质粒pBV221和pPIC9K为表达载体,成功构建了PRRS病毒E基因克隆载体,转化后经抗性筛选、PCR扩增、双酶切鉴定,确认得到了含有目的基因的阳性克隆。对含有E蛋白原核表达载体的阳性克隆进行诱导表达,经过酶联免疫鉴定,结果显示外源蛋白在宿主菌中有表达,成功实现了在大肠杆菌细胞中的克隆。本研究成功构建了PRRSV BJ-4毒株E基因的原核表达载体和真核表达载体,为基因工程疫苗的研制奠定了基础。
关键词：
PRRSV 基因克隆 原核表达 真核表达
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