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[期刊] 西南农业学报
[作者]
王闵霞 张晓东 张志雄 王平 张志勇 蔡平钟
本研究建立了以水稻叶绿体来源的trnA、trnI为同源重组片段,水稻叶绿体来源的Prrn为启动子,烟草叶绿体来源的Tps-bA为终止子,EPSP为筛选标记基因,GFP为外源基因,并含有两个多克隆位点(MCS)的"水稻通用叶绿体表达载体":pBAC823-NdeI-trnA-ApaI-XhoI-Prrn-AgeI-SalI-GFP-KpnI-SmaI-PacI-tpsba--HindIII-Prrn-EPSP-tpsba-EcoRI-trnI-NotI-pBAC823,并将其命名为pBAC8234。酶切试验结果证明,载体pBAC8234上GFP基因两侧设计的酶切位点为单克隆酶切位点,可用于后续实...
关键词：
水稻 叶绿体 表达载体 通用 MCS
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李轶女 孙丙耀 苏宁 孟祥勋 张志芳 沈桂芳
【目的】建立外源基因在水稻叶绿体中的表达体系。【方法】通过分析已公布的水稻叶绿体基因组全序列及其基因分布特点,选择ndhF与trnL的基因间序列作为除草剂PPT抗性基因bar定点整合的位点。以水稻叶绿体基因组DNA为模板,采用PCR方法克隆了两个适于水稻叶绿体基因组遗传转化的同源片段,构建了含水稻叶绿体16S高效表达启动子、外源基因bar、psbA基因的3′序列(终止子)以及两个同源片段的水稻叶绿体特异表达载体pRB。【结果】采用基因枪法转化水稻品种中花10号幼穗诱导的愈伤组织,并再生植株,获得转化体后代种子。对转化植株进行的分子检测结果表明,外源基因bar可能被整合到水稻叶绿体基因组中。后代...
关键词：
水稻 同源片段 bar基因 叶绿体转化
[期刊] 中国农业科学
[作者]
赵彤 于荣 黄丛林 王永勤 张秀海 吴忠义
【目的】验证高羊茅叶绿体表达载体在高羊茅叶绿体中的瞬时表达情况,为今后在高羊茅叶绿体中稳定表达该载体,获得耐旱高羊茅的叶绿体转基因株系奠定基础。【方法】首先从高羊茅草叶绿体基因组中克隆16S/trnI-trnA/23S片段,作为定点整合同源片段。然后将耐旱相关基因酵母海藻糖合酶基因tps1与水稻叶绿体16SrRNA基因的强启动子Prrn、烟草叶绿体基因psbA的终止子构建表达盒(Prrn-tps1-TpsbA-ter),连同草丁膦抗性基因bar表达盒、卡那霉素抗性基因nptII和绿色荧光蛋白基因gfp构建的融和基因表达盒一起克隆到定点整合同源片段之间,构建高羊茅叶绿体的稳定表达载体gTKGB。...
[期刊] 华北农学报
[作者]
赵彤 黄丛林 张秀海 于荣 王永勤 吴忠义
Tps1是生物保护物质海藻糖的关键合酶基因。构建含Tps1的玉米叶绿体表达载体,首先从玉米叶绿体基因组中克隆16S/trnI-trnA/23S片段,作为定点整合同源片段;然后将编码酵母海藻糖合酶基因Tps1表达盒(Prrn-Tps1-TpsbA-ter)、草丁膦抗性基因Bar表达盒(RpsbApro-Bar-RpsbAter)、卡那霉素抗性基因Npt II和绿色荧光蛋白基因Gfp构建的融和基因表达盒(Prrn-Npt II/Gfp-RrbcLter)一起克隆到定点整合同源片段之间,构建了玉米叶绿体的稳定表达载体mTKGB。通过基因枪轰击法将mTKGB转化到玉米幼嫩叶片中,培养2 d后,在激光扫...
[期刊] 华北农学报
[作者]
王玉华 韩晓玲 黄丛林 贾敬芬
利用叶绿体基因组进化中高度保守的特点,根据烟草叶绿体基因组全序列设计合成引物,从菊苣叶绿体基因组中扩增包括rps7-rps12-trnV-16S rDNA基因在内的一段序列(GenBank登录号为GQ199478),并以此作为定点整合外源基因的同源重组片段。以叶绿体基因强启动子prrn驱动选择标记基因aadA及报告基因gfp构建多顺反子表达盒prrn-aadA-gfp-psbA-3,′然后将表达盒克隆进菊苣叶绿体同源片段中,获得菊苣叶绿体定点整合表达载体pJAG,酶切分析证明所构建的载体符合预期设计。该载体的构建为建立菊苣的叶绿体转化体系奠定基础,为进一步通过叶绿体基因工程手段将更多感兴趣的基...
[期刊] 华北农学报
[作者]
王双 杨瑞 白薇
为研究水稻WRKY蛋白在应对各种生物以及非生物胁迫中发挥的作用,探明OsWRKY76是否参与调控水稻系统获得抗性,明确OsWRKY在植物抗病及耐逆反应过程中的作用机理,对OsWRKY76进行了氨基酸序列分析,发现OsWRKY76具有典型的WRKY结构域,属于WRKY-GCM1锌指WRKY超家族。克隆了OsWRKY76中300 bp的cDNA片段OsWRKY76-300,并扩增GUS基因中500 bp的片段作为连接物,通过片段末端人为增加的酶切位点将上述片段与Gateway系统的入门载体pENTR L16连接,形成中间由GUS 500连接、两端是OsWRKY76-300反向重复的发夹结构的载体,利用LR反应将dsWRKY76 pENTR L16中发夹结构的插入片段分别重组到诱导型双元载体GVG-TA7002和组成型双元载体Ubi-C1300中,获得RNA干扰载体。利用农杆菌介导的转化方法将诱导型双元表达载体转化水稻,获得7个转化株系。利用实时定量RT-qPCR检测转化株系中OsWRKY76的表达量,获得了2个沉默株系。
[期刊] 华北农学报
[作者]
孙琦 刘香玲 张宁 余柏胜
水稻苗期冷害是导致水稻减产的重要因素之一。为了发掘新的耐冷基因、诠释其耐冷分子机制并应用分子育种的手段提高水稻苗期耐冷性,前期已通过Northern表达分析,从已构建的水稻苗期低温诱导表达正向抑制差减cDNA文库中,发现了一个受低温诱导上调表达的功能未知的C2H2型锌指结构域蛋白新基因(特命名为OsCOI)。本研究进一步通过RT-PCR的方法从水稻中克隆了该基因,构建了其植物过表达载体,并通过农杆菌介导转入水稻基因组中,获得了其过表达转基因水稻株系,为进一步研究该基因的功能并探讨其在水稻耐冷分子育种中的应用价值奠定了基础。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
王海光 张洪亮 段俊枝 李自超
为研究水稻肌醇加氧酶基因在植物水分胁迫分子应答中的作用,采用RT-PCR技术克隆了水稻肌醇加氧酶基因的cDNA编码区,命名为OsMIOX。该基因由927个碱基组成,编码308个氨基酸,与拟南芥肌醇加氧酶的氨基酸序列相比,同源性为78%。将克隆的OsMIOX基因连接pCAMBIA-1301载体,成功构建了35 s启动子驱动的植物超表达载体。实时定量PCR分析结果表明,水分胁迫下OsMIOX基因在旱稻IRAT109中上调表达,在旱稻(IRAT109和毫格劳)中的表达量显著高于水稻(越富和日本晴)。这说明水稻和旱稻的水分胁迫分子反应机制的确存在差异,而这种差异很可能就是水、旱稻抗旱性不同的原因之一。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
周丽英 李虎 丁玉梅 卜璐璐 侯思明 许俊强 张应华 杨正安
以四季耐抽薹生菜为材料，ＰＣＲ扩增并克隆了生菜质体ＲＰｏ Ａ基因的两侧翼的基因片段，利用该两基因区段作为定点整合外源基因的同源重组片段，构建了生菜质体定点转化载体Ｐ ＢＲＰｏ Ａ－ＧＦＰ，并进行了原核表达分析。结果表明，ＰＣＲ所扩增的两条基因区段大小为１．２与１．１ ｋＢ。进行序列分析后，经酶切、连接和转化，构建成含ＰＲＲｎ－ＧＦＰ－ＡＡｄ Ａ－ＴＰｓＢ Ａ表达盒的质体表达载体，酶切鉴定表明，所构建载体符合预期设计；ＧＦＰ基因能够在质体特异性启动子ＰＲＲｎ及终止子ＴＰｓＢ Ａ的调控下高效表达，表达量约占总可溶性蛋白的４５．６％，包涵体占菌体蛋白的４７．５％，该载体的构建为后期生菜质体转化体系的．．．
[期刊] 中国农业科学
[作者]
陆云华 马立新 严红
目的尝试水稻质体多顺反子定点整合表达载体转化到烟草质体中表达。方法根据已发表的相关序列,分别设计引物,通过PCR技术克隆了一系列构建水稻质体多顺反子定点整合表达载体所需的元件:质体核糖体(16S)RNA操纵元启动子(Prrn)、质体psbA基因3′端终止子(psbA3′)、氨基糖苷3′-腺苷酰基转移酶基因(aadA)、水稻质体基因组高频同源重组片段(psbC/trnG,大小3362bp),命名为crDNA、甘露聚糖酶基因(man)、绿荧光蛋白基因(gfp)。构建了水稻质体多顺反子定点整合表达载体pLM21(-psbC-Prrn-RBS-man-RBS-gfp-RBS-aadA-psbA3′-t...
[期刊] 华北农学报
[作者]
田华 徐春霞 段美洋 黎国喜 唐湘如
利用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)得到在水稻中特异性表达的脯氨酸氧化酶(PRO)基因。DNA序列分析表明,所获得水稻的PROcDNA的最大开放阅读框序列全长为1 428 bp,可编码476个氨基酸。该序列与NCBI网站上已发表的PRO基因100%相似。为了能进一步验证所克隆的序列是我们所需的目的基因,成功构建了PRO基因超表达载体和PRO基因干涉载体,便于导入水稻中进行基因的功能鉴定。
关键词：
香稻 脯氨酸氧化酶 基因 克隆 表达载体
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘焕焕 朱志炎 刘之恩 何勇 张德清 田志宏
为了探究水稻油菜素内酯不敏感1相关受体激酶1前体物质OsBAK1P对水稻相关农艺性状的影响。通过以中花11粳稻品种为材料，根据基因所设计的特异性引物从水稻穗部cDNA中扩增得到CDS片段大小为651 bp的目的序列片段；通过酶切酶连的方法成功构建了PTCK303-OsBAK1P过表达载体和PTCK303-OsBAK1P RNA干扰载体；用农杆菌EHA105菌株转化表达正确的载体质粒并利用基因CDS扩增引物检测菌落筛选出阳性农杆菌克隆；再利用农杆菌遗传转化法侵染中花11粳稻品种的愈伤组织从而获得转基因植株；最后，相比较于中花11挑选2个表型相似的过表达、RNA干扰的T_1转基因植株测定并分析株高、穗长、叶夹角等农艺性状的变化和萌发初期的根长、胚芽鞘长度的变化以及对芸苔甾内酯(BL)的响应程度。结果表明，OE-OsBAK1P转基因水稻植株株高矮化，穗长变短，叶片夹角下降，种子萌发后根长增长而幼苗长度缩短，叶片对BL的响应不敏感；而RNAi-OsBAK1P转基因水稻植株株高增加，穗长变长，叶片夹角增加，种子萌发后根长缩短而幼苗长度增长，叶片对BL的响应敏感。综上，这些结果为改变水稻植株结构进而增加籽粒产量提供理论支持并可能为后续研究OsBAK1和前体物质OsBAK1P的其他功能提供参考。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
张文茂 彭楠 佘群新 葛向阳
利用araS启动子并在穿梭载体pZC1及pEXA的基础上构建硫化叶菌超表达载体pZC2,成功超表达了带有C端6×His标签序列的DNA双链断裂修复蛋白Mre11,进一步采用共纯化法鉴定到Mre11蛋白的作用配体Rad50,确定上述蛋白在高浓度盐(500mmol/L NaCl)中仍能形成MR复合体,表明该复合物在逆性条件下可能仍保持DNA断链修复的功能。进一步共纯化分析表明,基因组DNA片段是MR复合体形成的必需条件,在缺乏基因组DNA片段的情况下古菌分子伴侣蛋白结合并可能保护Mre11,该表达系统能够有效地应用于鉴定蛋白质的体内作用网络。
[期刊] 华北农学报
[作者]
王青云 王润青 方聪燕 侯佩 苏亮 李建平 宋梅芳 杨建平 李雪梅 吴大付
为克隆水稻蛋白磷酸酶6(PP6)催化亚基基因OsPP6C,并构建该基因的过表达载体以及进行生物信息学分析。采用RT-PCR技术从水稻中花11叶片cDNA中扩增OsPP6C基因全长,并构建与GUS融合的pBI121-OsPP6CGUS表达载体。通过生物信息学方法分析了OsPP6C蛋白的理化性质、与拟南芥AtPP6C(即AtFyPP)之间的同源性以及不同物种间的系统发育关系,此外,对OsPP6C基因的启动子进行了顺式作用元件分析。结果表明,该基因转录序列包含一个912 bp的开放阅读框,编码303个氨基酸残基,蛋白的分子量约为3.47 kDa,等电点为5.13;具有疏水性,但不存在信号肽,属于非分...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张文惠 张红心 樊圃 陈亮 山仑
采用RT-PCR技术克隆了水稻O-甲基转移酶ZRP 4基因的cDNA片段,并进行了序列测定与分析。结果表明,该序列全长1 101 bp,编码366个氨基酸,与G enB ank中水稻ZRP 4基因序列比对,核苷酸同源性为99.8%,氨基酸同源性为99.7%。将克隆片段插入中间载体pBPFΩ7,经H indⅢ酶切回收带有P 35s启动子和nos终止子片段,连接pCAM B IA 1301载体,成功构建ZRP 4基因的植物表达载体。
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