【目的】蛋白酶抑制剂(protease inhibitor,PI)是一类广泛存在于植物中的蛋白质,具有抵御植食性昆虫取食危害的功能。然而,水稻(Oryza sativa)PI基因在二化螟(Chilo suppressalis)取食过程中的表达模式尚不清楚。本研究旨在分析水稻蛋白酶抑制剂基因OsLTPL164和OsLTPL151在二化螟取食及机械损伤下的表达模式,为明确OsLTPL164和OsLTPL151在水稻防御二化螟中的作用及今后利用这两个基因构建转基因水稻株系打下基础。【方法】以东北地区常规种植的3个水稻品系辽盐2号(1654)、辽星17号(1665)和长白17号(1688)为研究对象,在二化螟危害关键时期(分蘖期)通过机械损伤和接虫处理,在处理后不同时间(0、3、6、12、24、48、72 h)分别对根、茎、叶3个组织进行取样,利用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测3个水稻品系中OsLTPL164和OsLTPL151的表达模式。【结果】OsLTPL164在3个品系中的组织表达模式一致,在叶片和茎中的表达量均高于根部;OsLTPL151在3个品系中的组织表达模式不一致,在1654品系中茎和叶片中的表达量显著高于根部,但在1688和1665品系中根部的表达量显著高于茎和叶片;此外,这两个基因在3个品系间的相同组织中都有不同的表达模式,OsLTPL164在根、茎、叶中均呈现在1665品系中表达量最高、在1688品系中表达量次之、在1654品系中表达量最低的表达模式,但OsLTPL151在不同组织中的表达模式与OsLTPL164不同:在根中,OsLTPL151在1665品系中的表达量明显高于1688和1654品系;在茎中,OsLTPL151在1654和1665品系中的表达量明显高于1688品系;在叶中,OsLTPL151在1654品系中的表达量明显高于1665和1688品系。二化螟取食诱导OsLTPL164和OsLTPL151在3个品系的叶片中表达上调幅度高于茎和根,且在1665品系中上调的幅度较1688和1654品系中大。在二化螟取食和机械损伤处理不同时间后,两个基因均呈现表达水平先上升后下降再上升的趋势;OsLTPL164和OsLTPL151在机械损伤6 h后才被显著诱导表达,而二化螟取食3 h后便可诱导OsLTPL164和OsLTPL151上调表达。【结论】OsLTPL164和OsLTPL151在3个水稻品系中二化螟取食以及机械损伤均能诱导其表达,推测这两个基因可能与水稻抗二化螟有关,但这两个基因在不同水稻品系中其他具体的功能可能有所不同。

【目的】鉴定新的家蚕蛋白酶抑制剂,探讨其在抵御病原微生物入侵方面的功能。【方法】对家蚕蛋白酶抑制剂BmSPI37进行T-A克隆、多序列比对、系统发育树构建、原核表达、RT-PCR时空表达特征及微生物诱导分析。【结果】克隆、表达了1个新的丝氨酸蛋白酶抑制剂,命名为BmSPI37。时空表达特征分析表明,BmSPI37在家蚕5龄幼虫后期表达量很高,而且在中部丝腺中高量表达;在蛹向蛾的变态发育时期,BmSPI37在雌蚕中的表达量显著高于雄蚕。微生物诱导试验表明,BmSPI37在大肠杆菌、黑胸败血菌、球孢白僵菌感染后,强烈上调表达。【结论】推测BmSPI37与防御病原微生物入侵有关。

Serpin家族成员作为主要的丝氨酸蛋白酶抑制剂,通过调节一系列丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶的活性来调节蛋白酶级联反应,进而参与了包括血液凝结、补体激活、纤维蛋白溶解、炎症反应、肿瘤抑制和激素转运等大量的基本生物过程,在调节机体免疫及其它重要生理功能等方面发挥着重要作用。在前期研究中,从中国明对虾血细胞中克隆得到一个serpin型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因(Fc-serpin,GenBank登录号:DQ318857),初步研究显示它在转录水平参与了病原菌和白斑杆状病毒(WSSV)引发的中国明对虾先天免疫应答反应;利用原核重组表达系统,成功获得了重组的中国明对虾serpin型丝氨酸蛋白酶抑制剂(rF...

克隆决明胰蛋白酶抑制剂2(Cassia obtusifolia trypsin inhibitor 2,COTI2)基因序列,并考察其在不同环境下的表达模式。利用RACE方法克隆了COTI2基因的部分序列,利用定量PCR考察其在盐、低温、干旱及ABA处理下的表达模式。从决明种子c DNA中克隆出了长度为565 bp的基因片段,该片段具有典型的Kunitz蛋白酶抑制剂基因家族的结构域。将得到的序列提交GenBank,序列号为ku745416。对获得的COTI2的氨基酸序列进行比较分析,发现COTI2的P1位

采用RACE方法获得了脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin基因的cDNA序列。该基因全长1 516 bp,开放阅读框1 245 bp,编码414个氨基酸,其预测分子量为45.06 kD,理论等电点为5.694,并含有两个糖基结合位点。同源性分析发现其与斑节对虾(Penaeus monodon)同源性最高,达到49%。组织表达分析表明,serpin基因在脊尾白虾血细胞中表达量最高,其次是肝胰腺和鳃组织,在肌肉中表达量最低。不同盐度胁迫后脊尾白虾的血细胞serpin基因表达量在盐度胁迫8 h时显著高于对照组(P<0.05),肝胰腺组织中serpi...

为了研究鱼类半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)的功能并探索其在水产品加工和病害防治中的应用潜力,将改造后的中华鲟(Acipensersinensis)cystatinCcDNA亚克隆到原核表达载体pBV220,构建表达cystatinC的大肠杆菌基因工程菌。该工程菌经温度诱导、SDS PAGE检测,在约12.4kD处有一特异蛋白带,该特异蛋白的含量约为菌体总蛋白的25%。重组半胱氨酸蛋白酶抑制剂经洗涤、溶解、透析、复性后纯度为85%,实现了中华鲟cystatinC在大肠杆菌中的高效表达。木瓜蛋白酶活性抑制实验结果表明该重组cystatinC具有明显的酶活抑制作用。

杨树受损伤后能诱导一些基因的表达,其编码的蛋白质可能在杨树的防卫反应中起一定作用。用PCR方法从新疆杨叶片中克隆出一个损伤诱导型Kun itz胰蛋白酶抑制剂基因PaTI1。序列分析表明:此基因不含内含子,其翻译起点上游具有‘TATA’和‘CCAAT’等转录控制元件,包含的阅读框架能编码一个长为213个氨基酸的多肽。此多肽与克隆自美洲山杨的PtTI2和PtTI1氨基酸序列同源性最高,分别为95%和80%,其N端存在一长度为27个氨基酸的信号肽。将此基因以融合蛋白的形式在大肠杆菌中进行表达,纯化后的融合蛋白对胰蛋白酶的活性有抑制作用,每8.5μg融合蛋白可完全抑制1μg牛胰蛋白酶的活性。W est...

【目的】应用RNA干扰技术同时抑制大豆脂肪氧化酶(Lox)和胰蛋白酶抑制剂(KTi)基因的表达,改良大豆品质,培育缺失Lox和KTi的大豆新材料。【方法】应用RNAi原理,以双价RNAi植物表达载体pCAM-BIA1301-KtiRi-LoxRi为基础,以植物表达载体pCAMBIA3301的质粒DNA为模板,利用CaMV35S启动子的上游引物和CaMV35S终止子的下游引物,PCR扩增含有除草剂抗性基因bar的整个表达原件,然后将其插入到pCAM-BIA1301-KtiRi-LoxRi中,构建以除草剂为筛选标记的双价RNAi表达载体,并通过花粉管通道法转化至大豆吉农18、吉农28和吉农27 3...

Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂可以通过精确调控丝氨酸蛋白酶的活力,在生物体的防御应答等众多生物过程中发挥重要作用。以前期克隆的中国明对虾Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因(Fc-Kazal,GenBank注册号为DQ318856)为基础,对其功能结构域进行序列比对和进化分析;组织表达分析结果表明,该基因在血细胞、鳃和淋巴器官等组织中高水平表达,而在眼柄、神经和肌肉中无表达;利用原核表达系统对该基因成熟肽区域成功进行了重组表达,纯化后的目的蛋白最终得率为0.4 g/L培养液;活性分析结果显示,复性后的rFc-Kazal对鳗弧菌、金黄色葡萄球菌、杀鲑气单胞菌、苏云金芽孢杆菌有明显的抑菌作用。

为研究冷诱导转录因子CBF1(C-repeat-binding-factor)基因对我国优良豆科牧草——苜蓿的抗寒性的改良作用,试验从拟南芥(Arabidopsis thaliana)中利用PCR方法分离了CBF1基因及其启动子,分别构建了CaMV 35S启动子和来源于拟南芥的CBF1启动子驱动的农杆菌介导的植物转化表达载体,为下一步研究利用CBF1基因改良苜蓿抗逆性奠定了基础。

虫害是杨树造林生产中所面临的一大难题。通过农杆菌介导 ,将经过人工改造的苏云金杆菌杀虫结晶蛋白 (Bt)基因转化杨树 ,得到杨树再生植株 ,然后 ,再将蛋白酶抑制剂基因 (PI)导入已含Bt基因的转基因杨树 ,经PCR检测和Southern杂交分析证明 ,最终获得既含有Bt基因又含有蛋白酶抑制剂基因的转基因杨树植株。利用这种杨树叶片饲喂舞毒蛾幼虫的杀虫试验结果表明 ,转基因杨树具有明显的杀虫活性 ,同时表明含有Bt基因和蛋白酶抑制剂基因双基因的植株其抗虫能力明显高于仅含单一Bt基因的植株。为探索培育高抗虫性杨树开辟了一条新途径。

【目的】鉴定家蚕(Bombyx mori)半胱氨酸蛋白酶抑制剂,并对其表达特征及调控进行分析,为深入研究半胱氨酸蛋白酶抑制剂在家蚕变态发育中的作用提供数据支持。【方法】根据家蚕基因组数据库和Primer 5.0软件设计BmCPI40去信号肽引物,对家蚕半胱氨酸蛋白酶抑制剂BmCPI40进行克隆,利用Clustal X和MEGA4.0软件对BmCPI40进行氨基酸序列和进化关系分析。采用原核表达系统对重组的BmCPI40进行表达、纯化和抗体的制备。运用RT-PCR和q PCR技术在核酸水平分析BmCPI40时空表达特征,利用Western和免疫荧光技术分别对BmCPI40进行蛋白水平检测和组织定...

研究了大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)对鲢肌肉中肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(MBSP)引起的肌原纤维蛋白降解作用的影响。大豆胰蛋白酶抑制剂经高度纯化后加入肌原纤维中以判断它对MBSP的抑制效果。在不添加STI的情况下,55℃加热30min即可观察到肌球蛋白重链的分解,延长加热时间则可检测到肌动蛋白及原肌球蛋白的降解。相反,在终浓度为0.75μg·mL-1的STI存在下,包括肌球蛋白重链在内的肌原纤维蛋白降解均能得到有效抑制,表明STI是MBSP的特异性抑制剂。由于肌球蛋白重链及肌动蛋白的完整性是构成鱼糜制品凝胶强度的主要因素,因此,STI的添加有可能提高鲢鱼糜制品的凝胶强度。

为研究植物营养与其抗性的关系,对兴安落叶松和长白落叶松在不同结实情况下针叶内PAL、PPO、TI和CI活性的变化规律进行分析。结果表明:2种落叶松都表现为在结实量较少或无时,其防御酶及蛋白酶抑制剂的活性较高,且与结实量中等或结实量较多时的防御酶及蛋白酶抑制剂的活性存在显著差异(P0.05)。落叶松抗虫性的强弱与其结实量有直接的关系,但与种类关系不大。

以野生茄托鲁巴姆为材料,在利用SSH文库获得基因片段的基础上,采用RACE方法克隆了1个蛋白酶抑制剂Ⅱ型基因的全长cDNA序列,命名为StPI1。StPI1 cDNA序列全长790bp,含有29bp的5′-UTR和201bp的3′-UTR,编码包含202个氨基酸的前体蛋白。StPI1前体蛋白N末端1~27位为信号肽,成熟蛋白含有3个保守的蛋白酶抑制剂Ⅱ结构域。预测StPI1蛋白含有1个磷酸化位点、1个糖基化位点和3个N端酰基化位点。表达模式分析表明,在黄萎病菌侵染后,StPI1在托鲁巴姆根中呈上调表达。