为了阐明水稻膜联蛋白基因家族成员OsAnn8在干旱和低温胁迫条件下的功能作用机制,通过荧光定量PCR技术对不同干旱和低温处理下的水稻叶片中OsAnn8基因进行转录水平上的定量分析,结果表明,OsAnn8基因在干旱胁迫处理前后表达量呈现出高-低-高的变化趋势,而在冷胁迫处理前后表达量则呈现出低-高-低-低的变化。随后,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对OsAnn8基因进行定点编辑,并借助农杆菌介导将OsAnn8基因靶位点的CRISPR/Cas9基因编辑植物表达载体导入转基因受体品种TP309,经潮霉素筛选后共获得32株转基因阳性植株,靶位点扩增测序峰图分析表明其中的2个单株出现了重叠峰,进一步的T载体克隆分别测序表明,这2个单株为单等位基因敲除,说明本研究已经成功获得了OsAnn8基因靶位点敲除的单等位突变体,不同类型的水稻OsAnn8基因突变体的创建,为水稻膜联蛋白基因家族成员OsAnn8在非生物胁迫条件下的功能研究奠定了材料基础。

为挖掘花生抗逆境胁迫相关基因,克隆抗逆相关膜联蛋白Annexin基因,以花生品种花育25号为试验材料,从已知抑制消减杂交文库中获得花生膜联蛋白Annexin类似基因片段,通过RACE技术获得Annexin基因5'-RACE片段。对5'-RACE序列和抑制消减杂交文库中已知基因片段进行拼接,设计特异引物通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增得到该基因,命名为AhAnn1。结果表明,AhAnn1全长为1 277 bp,开放阅读框为951 bp。根据编码区预测AhAnn1编码一条316个氨基酸组成的多肽

以‘津研四号’黄瓜品种为材料,克隆得到一个黄瓜膜联蛋白基因的cDNA全长,命名为CsANN2。为进一步探究黄瓜CsANN2基因的功能,对CsANN2基因编码的蛋白序列进行生物信息学分析后,发现其理化性质、保守结构域以及多个功能蛋白位点都和其他植物的膜联蛋白一致。系统进化树分析表明,黄瓜CsANN2与AtANN2、AtANN6、AtANN7、BjANN2和BjANN6有较近的亲缘关系。亚细胞定位结果显示,CsANN2蛋白在细胞膜、细胞质与细胞核内都有分布。qRT-PCR结果分析表明,CsANN2基因受ABA、SA、PEG和H2O2诱导表达,但对NaCl胁迫无响应。

【目的】稻米香味是水稻品质改良的一个重要内容,其性状主要受1个隐性基因Badh2的控制。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将常规品种中的Badh2进行编辑,从而获得Badh2发生突变的基因编辑株系,使香味性状得到改良。【方法】利用CRISPR/Cas9基因编辑的原理,在水稻Badh2的第2和第7外显子处设计靶点,通过BLAST分析确定其特异性并构建到CRISPR/Cas9表达载体。以浙江省主要推广的水稻品种嘉58和秀水134的愈伤组织为受体,利用农杆菌介导的遗传转化法,通过潮霉素抗性筛选获得阳性转基因植株。转基因株系经测序明确其在Badh2的突变类型,经PCR分析与鉴定获得Badh2发生突变并无转基因标记成分的稳定株系。利用气相色谱质谱联用仪(GC-MS)检测基因编辑株系糙米米粉中2-AP的含量,明确其香味成分与非转基因对照之间的差异。【结果】在水稻第2和第7外显子处设计靶点构建表达载体,通过遗传转化转基因株系的Badh2完成了定向突变。共获得T_0代嘉58基因编辑的株系15株,在第2外显子处发生突变的有8株5种不同的突变类型,均为不同单碱基插入不同位点;在第7外显子处发生突变的有7株5种不同的突变方式,均为碱基或片段缺失。获得秀水134基因编辑的株系11株,在第2外显子处共有5株,均为单碱基插入;在第7外显子处有6株,均为片段缺失。48株T_1代秀水134基因编辑株系中,共获得16株无转基因标记的基因编辑株系,其中5株在第2外显子发生突变,11株在第7外显子处发生突变。4个T_2代基因编辑株系的米粉中2-AP平均含量分别为0.309、0.347、0.332和0.295μg·g~(-1),极显著(P<0.01)高于非转基因对照(0.046μg·g~(-1))。【结论】利用CRISPR-Cas9技术可对水稻香味基因Badh2进行定向编辑,并且可获得无转基因成分的基因编辑株系,其香味性状得到明显改良。

【目的】易落粒既不利于稻谷收获,也不适宜于水稻机械化生产。利用现阶段前沿的分子育种手段——CRISPR/Cas9技术对水稻落粒性主效基因qSH1进行定点编辑,并调查分析易落粒性状的改良效果,为创制稳产和适合机械化生产的水稻新种质奠定材料基础和探索新途径。【方法】以qSH1为靶标基因,根据CRISPR/Cas9技术原理设计靶标位点。将所设计的靶点序列在水稻参考基因组中比对分析以排除非特异性靶位点,最终筛选出qSH1-T1和qSH1-T5靶标位点。化学合成靶位点寡核苷酸序列,退火后分别与pYLg RNA-U3、pYLg RNA-U6a载体连接构建U3-qSH1T5-g RNA、U6a-qSH1T1-g RNA表达盒,最后将2个g RNA表达盒同时连接至pYLCRISPR/Cas9表达载体中,构建pYLCRISPR/Cas9-qSH1-T51表达载体。利用农杆菌介导转化易落粒的籼稻品种HR1128,以潮霉素抗性为筛选标记筛选获得T0代转基因阳性植株。利用靶位点扩增测序法判断T0代转基因植株在预期靶标位点是否发生突变,并进一步分析突变类型及基因型。将靶点序列在水稻参考基因组中比对,选择与靶点序列匹配度大于或等于15 bp且3′端具有NGG的位点作为潜在脱靶位点进行脱靶效应评估。利用潮霉素基因及靶点检测进一步筛选无T-DNA成分的qsh1突变植株并进一步构建qsh1突变系,并分析qsh1突变系的落粒性、qSH1的表达量及预测编码氨基酸序列。【结果】pYLCRISPR/Cas9-qSH1-T51载体成功地实现了对qSH1靶标位点的定点编辑。在T0代转基因阳性植株中获得7个突变单株,其中qSH1-T1和qSH1-T5靶点的突变频率分别为54.55%和63.64%,突变基因型包括纯合突变、杂合突变、双等位突变和嵌合突变,突变类型包括碱基插入、碱基缺失及碱基突变。通过对T1代植株进行潮霉素基因筛选、靶位点扩增测序,结果表明,在T1代植株中Cas9载体骨架和qSH1突变位点都发生了分离,获得2种不含T-DNA成分的qsh1纯合突变株,并以此构建2个T2代qsh1纯合突变系群体(17SZ01和17SZ02)。对46株转基因阳性植株进行脱靶效应分析,发现3个潜在脱靶位点均未发生突变,表明所设计的靶标位点具有较高的特异性。通过落粒性测定分析表明,与野生型对照相比,2个qsh1纯合突变系的落粒性显著降低。进一步分析发现,2个突变系氨基酸翻译均发生改变并提前终止,同时17SZ01突变系qSH1的表达量显著降低。【结论】利用CRISPR/Cas9技术对水稻基因组进行定点编辑定向改良水稻品种落粒性,是一条高效、安全的分子改良育种策略。

【目的】利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因组编辑技术获得编辑BMPR-IB(bone morphogenetic protein receptor,type IB)基因的猪胎儿成纤维细胞(pig fetal fibroblasts,PFF),并研究该基因被编辑后对骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)信号通路中重要功能基因表达的影响。【方法】针对猪的BMPR-IB基因的外显子8,利用在线软件http://crispr.mit.edu获得了21条sg RN

【目的】OsIAA11参与的生长素信号途径在水稻生长发育阶段和环境因子响应中起重要作用,并影响水稻生育后期的产量形成过程。利用CRISPR/Cas9编辑技术对粳稻中花11(ZH11)的OsIAA11序列进行编辑,获得OsIAA11突变植株,通过对突变植株的农艺性状指标开展田间调查分析,以期探索OsIAA11突变对水稻产量构成因子的影响。【方法】依据CRISPR/Cas9编辑原理,在OsIAA11第1和第2外显子区域设计2个20 bp的编辑靶点,并在水稻基因组数据库中比对分析靶点序列,排除非特异性编辑,将2个靶点核苷酸片段分别与pYLgRNA-U6a和pYLgRNA-U6b载体连接,通过2次PCR扩增,得到含特异性连接接头的U6a-IAA11-T1和U6b-IAA11-T2表达盒,再将2个表达盒连接到pYLCRISPR/Cas9-MT载体上,获得pYLCRISPR/Cas9-IAA11-T12重组表达载体,利用农杆菌介导法转化ZH11愈伤组织,再生培养得到T0代转基因幼苗,通过PCR扩增潮霉素抗性基因获得阳性株系。对T2代植株的靶点区域序列进行PCR扩增和测序分析,鉴定OsIAA11突变类型,并考察突变植株的田间农艺性状。【结果】pYLCRISPR/Cas9-IAA11-T12表达载体成功转化ZH11水稻愈伤组织,并获得25株转基因再生植株,经潮霉素鉴定得到20株阳性株系,从阳性植株的T2后代中鉴定出17种在2个靶点区域都发生编辑的纯合突变类型植株,除osiaa11-20-1、osiaa11-21-2、osiaa11-23和osiaa11-25在第1个靶点、以及osiaa11-22-2在第2个靶点是单碱基插入突变外,其他突变植株在第1个靶点为小片段缺失突变,在第2个靶点多为单碱基缺失突变。对17种不同基因型osiaa11突变体的农艺性状调查表明,与野生型水稻相比,突变体水稻的株高、有效穗数、穗长、穗粒数、结实率、千粒重、收获指数以及谷草比等性状未发生明显变化,而分蘖成穗率则显著降低,表明无效分蘖增多。【结论】采用CRISPR/Cas9技术对OsIAA11序列进行编辑,得到17种不同基因型的osiaa11突变体水稻,其分蘖成穗率显著降低,无效分蘖变多,表明OsIAA11参与了生长素对分蘖芽发生的调节代谢。

当外源ＤＮＡ通过转基因技术导入植物细胞后，会以同源重组或非同源重组两种不同的方式整合到基因组中，进而获得相应的目标性状。外源ＤＮＡ与受体细胞序列相同或相近的位点发生重新组合，从而整合到受体细胞的染色体上称之为同源重组；当发生了ＤＮＡ双链断裂的细胞为了避免ＤＮＡ或染色体断裂而造成ＤＮＡ降解或对生命力的影响，而强行将２个ＤＮＡ断端彼此连接在一起时则为非同源重组。发生非同源重组的细胞其基因组常出现核苷酸片段的插入和／或缺失以及其他突变等多种情况，使得研究者无法得到精确控制的突变结果；而发生同源重组的细胞基因组序列通常不变，通过加入同源重组的供体ＤＮＡ，可以实现对基因组的精确修饰和改造。由于在植物中产．．．

当外源DNA通过转基因技术导入植物细胞后,会以同源重组或非同源重组两种不同的方式整合到基因组中,进而获得相应的目标性状。外源DNA与受体细胞序列相同或相近的位点发生重新组合,从而整合到受体细胞的染色体上称之为同源重组;当发生了DNA双链断裂的细胞为了避免DNA或染色体断裂而造成DNA降解或对生命力的影响,而强行将2个DNA断端彼此连接在一起时则为非同源重组。发生非同源重组的细胞其基因组常出现核苷酸片段的插入和/或缺失以及其他突变等多种情况,使得研究者无法得到精确控制的突变结果;而发生同源重组的细胞基因组序列通常不变,通过加入同源重组的供体DNA,可以实现对基因组的精确修饰和改造。由于在植物中产...

【目的】分离水稻WRKY80,分析其编码蛋白的序列结构特征,了解其在各器官中以及病原接种、激素处理下的表达模式,为阐明其生物学功能奠定基础。【方法】基于水稻基因组数据库注释的Loc_Os03g63810基因的编码序列设计特异引物,用RT-PCR法从茉莉酸甲酯(MeJA)处理的水稻叶片中克隆WRKY80 cDNA序列,运用生物信息学手段对推定的蛋白和启动子序列进行分析,用Northern杂交或实时荧光定量PCR方法研究基因的表达模式。【结果】获得了WRKY80 cDNA序列,长1 392 bp,包含1个长1 164 bp的完整开放读码框,编码387个氨基酸。WRKY80具有1个典型的WRKY保守...

【目的】光作为一种环境信号,可影响植物的基因表达、酶活性和形态建成。光敏色素互作因子在光信号传导过程中起着重要作用。本研究旨在构建水稻光敏色素互作因子OsPIL15的CRISPR/Cas9表达载体,创制OsPIL15突变体,挖掘水稻功能基因,丰富和完善水稻光信号调控分子机制。【方法】依据CRISPR/Cas9技术原理,设计OsPIL15突变靶点。将所设计靶序列在水稻基因组中进行比对,排除非特异性靶位点,同时使该靶序列含有常用酶切位点,方便后期突变体鉴定。化学合成靶位点寡核苷酸序列并与载体pBUN411连接

【目的】休眠是水稻重要的农艺性状。适当的休眠可以抑制水稻的穗发芽现象，是确保产量和品质的关键因素。然而，水稻休眠调控的基因及其调控网络仍需进一步研究。已知基因MODD编码未知功能的蛋白，负向调控水稻脱落酸信号和抗旱性，但其调控水稻休眠的功能未知。研究MODD在调控水稻休眠中的功能，有助于完善水稻休眠调控网络，同时为抗穗发芽遗传育种提供新的理论基础和种质资源。【方法】根据RGAP数据库公布的基因序列，构建MODD的CRISPR-Cas9敲除载体，通过农杆菌介导的遗传转化方法转化中花11(ZH11)愈伤组织，从而获得水稻转基因植株；利用PCR扩增、测序技术及qRT-PCR技术筛选并鉴定MODD敲除纯合系；根据2个突变系（KO-1和KO-2）的CDS得到突变系的氨基酸序列，然后，用DNAMAN对比ZH11和2个突变系（KO-1和KO-2）的蛋白序列；利用Linux系统筛选出MODD在水稻中的同源基因；取开花后35 d的种子，调查ZH11和敲除系的发芽率；利用酵母单杂和LUC试验验证MODD的上游基因。【结果】查找到水稻中有6个MODD的同源基因，分别为LOC＿Os07g41160、LOC＿Os03g30570、LOC＿Os03g53630、LOC＿Os04g35430、LOC＿Os03g17050和LOC＿Os06g01170；成功构建了敲除载体，并转入ZH11中，获得2个纯合突变系（KO-1和KO-2）;qRT-PCR结果表明，2个突变系（KO-1和KO-2）的MODD表达量显著降低；蛋白序列分析表明，KO-1和KO-2的移码突变造成了蛋白翻译的提前终止；发芽率结果显示，2个突变系（KO-1和KO-2）的发芽率在吸水第3天比ZH11分别显著降低了15%和15%；之后差异逐渐扩大，在第6天差异达到最大，比ZH11分别显著降低35%和35%;2个突变系（KO-1和KO-2）的穗发芽现象显著低于ZH11；酵母单杂试验结果表明，在酵母中，ABI5可以结合MODD的启动子区域，并且进一步把结合范围缩小至300 bp以内；LUC结果显示，加入ABI5的荧光值是单独加NONE空载荧光值的2.6倍，说明ABI5可以激活MODD的表达。【结论】敲除MODD可以增加种子的休眠，MODD可能通过ABA信号途径调控种子休眠。

CRISPR/Cas9基因编辑技术已经成为水稻育种新型手段,香稻育种一直是水稻育种行业的研究热点,水稻香味主要由8号染色体上的甜菜碱脱氢酶基因Badh2控制。为了改良原有品种的香味性状,促进香稻育种的发展,以非香型粳稻品种东农425为试验材料,构建了2个CRISPR/Cas9敲除载体对Badh2基因进行定点编辑,第1个载体(p YLCRISPR/Cas9-B1-gRNA)的2个靶点分别位于第2和第3外显子上,第2个载体(p YLCRISPR/Cas9-B2-gRNA)的2个靶点均在第2外显子上。采用农杆菌介导法对东农425进行遗传转化,成功获得了T0纯合植株,并对其衍生出的T1植株进行T-DNA元件检测,共获得8个突变类型不同且不含有转基因成分的纯合突变株系。同时采用咀嚼法和氢氧化钾浸泡法对这8个纯合突变株系的水稻籽粒进行香味检测,结果表明,8个Badh2株系均具有不同程度的香味,总体上载体p YLCRISPR/Cas9-B1-gRNA编辑的3个株系的香味更为浓郁。对这8个纯合突变株系的主要农艺性状进行考察,发现突变株系的穗数、穗粒数、结实率及千粒质量与野生型相比均没有明显差异。综上,本研究对东农425的Badh2基因成功地进行了编辑,并获得了香味显著提高且无转基因成分的纯合突变体材料,为加快香型粳稻品种的培育提供了技术支持。

[目的] 本文旨在利用基因编辑技术，降低水稻直链淀粉含量，改善稻米食味品质特性，以培育直链淀粉含量降低的优质育种材料。[方法] 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，下调水稻品种‘宁粳4号’淀粉合酶基因（SSSIIb）的表达，对转基因家系进行目标基因的分子鉴定和主要农艺性状、生理生化指标的测定，选出目标育种材料。[结果] 对淀粉合酶基因SSSIIb进行多靶位点编辑，得到3个目标基因敲除的转基因家系，分别为SSS2-Q、SSS2-Z和SSS2-H家系。与‘宁粳4号’相比，SSS2-Q家系直链淀粉含量显著下降，支链淀粉链长分布呈现中等链长减少，而胶稠度和热浆黏度、冷浆黏度等指标均优于‘宁粳4号’，品质指标达到预期目标，但每穗实粒数和结实率降低，粒长增加。而在SSS2-Z与SSS2-H家系中，品质指标没有实现预期目标。RT-qPCR分析发现，SSS2-Q家系中SSSIIb基因表达下调，其他淀粉合成相关基因表达出现变化。[结论] 通过CRISPR/Cas9技术，靶向编辑了‘宁粳4号’中SSSIIb基因，降低了SSS2-Q家系直链淀粉含量，品质指标得到改善，为优质食味转基因水稻新品种培育提供新种质。

[目的]本文旨在利用Cas9蛋白/sgRNA体系，提高猪胎儿成纤维细胞的基因组编辑效率，为促进CRISPR/Cas9技术在猪上的广泛应用奠定基础。[方法]针对猪ROSA26位点的启动子区（包含第一外显子区）设计两条sgRNAs，并将其构建在PX459-Cas9-puro质粒上，以获得PX459-Cas9-sgRNA质粒。将sgRNA靶序列连同PAM序列构建在RGS-CR质粒上，以获得RGS-sgRNA质粒。使用PX459-Cas9-sgRNA质粒与RGS-sgRNA质粒系统共转染，筛选切割效率较高的一条sgRNA，并使用该sgRNA对猪胎儿成纤维细胞进行后续打靶实验。分别使用PX459-Cas9-sgRNA质粒和Cas9蛋白/sgRNA两种方法对猪胎儿成纤维细胞的靶位点进行基因敲除，将转染后的细胞提取基因组DNA，桑格尔测序检测打靶效率。[结果]成功构建了打靶猪ROSA26靶序列的PX459-Cas9-sgRNA质粒，及含PAM序列的RGS-sgRNA，且质粒测序结果显示序列插入正确；RGS-sgRNA筛选结果表明，sgRNA2的打靶效率极显著高于sgRNA1 (P < 0.01)，且sgRNA2无脱靶效应，因此后续使用PX459-Cas9-sgRNA2和Cas9蛋白/sgRNA2在猪胎儿成纤维细胞中进行打靶，并比较两者的打靶效率。在猪胎儿成纤维中，PX459-Cas9-sgRNA2质粒的打靶效率为16.67%，Cas9蛋白/sgRNA2体系的打靶效率为33.33%；[结论]Cas9蛋白/sgRNA体系较PX459-Cas9-sgRNA质粒提高了打靶效率约1倍，这对提高后续猪体细胞的基因敲入效率、促进基因编辑在猪上的应用有重要意义。