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[期刊] 华北农学报  [作者] 张恭  刘立峰  周维  王海光  马峙英  
利用已公布的水稻条纹叶枯病毒的序列和siRNA Target Finder软件,获得了168条siRNA片段,利用这些片段在水稻基因组中BLAST(Basic local alignment search tool),最终获得6条与水稻基因组完全不匹配的干扰序列。选择其中的2条,通过化学合成干扰序列,利用pCAMBIA1301质粒构建了RNA干扰载体pASV1301-1,pASV1301-2,并成功地转化EHA105农杆菌,为进一步转化水稻、探索利用RNA干扰技术防治水稻条纹叶枯病奠定了基础。
[期刊] 中国农业科学  [作者] 陈爱玲  林克剑  贺康  王桂荣  李飞  
【目的】探讨利用RNA干扰技术切断灰飞虱体内水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)繁殖的可行性,研究RSV病毒不同基因间的互作关系。【方法】利用喂食的方法测定体外合成的dsRNA对灰飞虱体内RSV基因表达的抑制作用。根据RSV基因序列设计并合成3种dsRNA(dsRdRp、dsNSvc4和dsCP),分别喂食携带RSV病毒的2龄灰飞虱,96 h后利用荧光定量PCR技术同时检测灰飞虱体内RSV病毒不同基因RdRp、NSvc4和CP的表达量。【结果】经过特异性dsRNA喂食处理的灰飞虱体内RSV病毒靶基因NSvc4、CP的表达量大幅下调,下调幅度分别为93.2%和94.9%;靶...
[期刊] 华北农学报  [作者] 王双  杨瑞  白薇  
为研究水稻WRKY蛋白在应对各种生物以及非生物胁迫中发挥的作用,探明OsWRKY76是否参与调控水稻系统获得抗性,明确OsWRKY在植物抗病及耐逆反应过程中的作用机理,对OsWRKY76进行了氨基酸序列分析,发现OsWRKY76具有典型的WRKY结构域,属于WRKY-GCM1锌指WRKY超家族。克隆了OsWRKY76中300 bp的cDNA片段OsWRKY76-300,并扩增GUS基因中500 bp的片段作为连接物,通过片段末端人为增加的酶切位点将上述片段与Gateway系统的入门载体pENTR L16连接,形成中间由GUS 500连接、两端是OsWRKY76-300反向重复的发夹结构的载体,利用LR反应将dsWRKY76 pENTR L16中发夹结构的插入片段分别重组到诱导型双元载体GVG-TA7002和组成型双元载体Ubi-C1300中,获得RNA干扰载体。利用农杆菌介导的转化方法将诱导型双元表达载体转化水稻,获得7个转化株系。利用实时定量RT-qPCR检测转化株系中OsWRKY76的表达量,获得了2个沉默株系。
[期刊] 华北农学报  [作者] 李臻  张贵林  王庆国  柳絮  李海青  姚方印  刘炜  
水稻黑条矮缩病是由水稻黑条矮缩病毒引起的水稻病害,该病可导致病株生长迟缓、矮化、抽穗结实困难,严重影响了水稻的生产。在水稻黑条矮缩病毒基因组不同双链RNA序列的基础上,分别设计了5对特异性引物,通过RT-PCR获得了相应片段,结合基因沉默的方法,分别构建RNA干扰载体,并进一步将发夹结构构建入以玉米泛素Ubi为启动子、以bar基因为选择标记的改造后的植物双元表达载体pCA1300-Ubi中,经农杆菌介导对黄淮稻区主栽水稻品种圣稻13进行遗传转化,成功获得了5个含有水稻黑条矮缩病干扰片段的植物双元表达载体,经农杆菌介导获得了部分水稻转化植株。旨在为下一步对水稻黑条矮缩病的研究及抗病水稻新品种的培...
[期刊] 华北农学报  [作者] 许宗宏  郝青南  陈李淼  孙佃臣  田星星  单志慧  
大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)是马铃薯Y病毒组(Potyvirus)成员之一,大豆花叶病毒病可造成大豆10%~30%的产量损失,并严重影响大豆的品质。不同株系间致病力差异源于它们在碱基序列上的差异。采用传统的抗病育种技术育成的抗病品种抗谱窄,品种抗性可因病毒株系的变异而丢失。依靠RNA引发的基因沉默改善植物的抗病毒能力是基于RNA i(RNA inference)原理建立的植物抗病毒新策略,本研究对来源于武汉SMV分离物的CP基因和Nib基因进行了克隆,通过对保守区域的扩增,采用Gateway技术构建了大豆抗花叶病毒的RNA干扰载体。为防治大豆花叶病毒新技术的...
[期刊] 华北农学报  [作者] 张瑞杰  苗向阳  
构建并鉴定了针对绵羊抑制素α亚基(INHA)基因的shRNA(Small hairpin RNA,shRNA)慢病毒干扰载体,为进一步制备优质、高产转基因绵羊奠定基础。设计并合成4条针对绵羊INHA基因的shRNA表达序列(shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4)及2条阴性对照序列(NC1、NC2),将其分别连接到空载体pGFP-V-RS中,得到4个shRNA表达载体(即shRNA干扰载体)pGFP-V-RS-shRNA和2个阴性对照载体pGFP-V-RS-NC;同时构建绵羊INHA的高效表达载体pIRES2-eGFP-INHA,然后将构建好的4个shRNA干扰载体及2个阴性对...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)  [作者] 操胜  杨增岐  
以A型流感病毒NP基因为靶标,设计并合成了3对编码发夹状siRNA寡聚核苷酸。将合成的序列互补的寡聚核苷酸退火形成双链,克隆至pSilencer 1.0-U6载体中,并转化DH5a菌株,氨苄抗性筛选阳性菌落,扩大培养后,提取质粒进行酶切鉴定,并进行测序分析。结果显示,酶切后得到预期长度的DNA片段;插入序列插入的位置与设计完全一致,无碱基缺失或突变。表明A型流感病毒NP基因小干涉RNA表达载体构建成功。
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)  [作者] 范国成  高芳銮  黄美英  谢荔岩  吴祖建  林奇英  谢联辉  
为构建携带水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus,RGDV)主要内层衣壳蛋白S3基因和外层衣壳蛋白S8基因的重组杆状病毒,将目的基因(S3和S8)分别亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacDual多角体启动子(PH)和p10启动子的下游.经酶切和确证性序列测定,将其转化到DH10Bac感受态细胞中,获得重组杆粒rbpFBDS3-S8,采用脂质体转染法,将rbpF-BDS3-S8转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9细胞包装病毒,PCR筛选鉴定重组病毒.结果表明:Sf9昆虫细胞被侵染72 h后,倒置显微镜下观察到细胞增大,培养液和细胞内出现颗粒状物...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)  [作者] 冶贵生  张彦明  徐浩  郭抗抗  
利用RNA干扰在线生物学软件分析猪瘟病毒NS3基因,设计针对NS3基因不同位置的小发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰序列(其结构特征为正链(19nt)-环(9nt)-负链(19nt))。化学合成这些序列,并退火连接为双链干扰片段,将双链干扰片段定向克隆到干扰载体中,构建重组载体pGene-NS3-1,pGene-NS3-2和pGene-NS3-3,转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,对转化产物进行kan+筛选,碱裂解法提取重组质粒,将酶切鉴定为阳性的质粒测序。结果显示,双链干扰片段克隆方向正确,序列中未出现核苷酸的插入,缺失等突变现象。表明靶向猪瘟病毒NS3基因shR...
[期刊] 西南农业学报  [作者] 熊文婕  谢芝勋  刘加波  庞耀姗  谢志勤  邓显文  谢丽基  
禽呼肠孤病毒σC基因是病毒粘附蛋白,σNS基因具有结合单链RNA活性。根据siRNA靶序列设计原则,设计并合成siRNA模板并克隆到shRNA表达载体pSilencer-CMV 4.1 neo。分别构建了针对σC基因的shRNA载体C1、C2、C3和针对σNS基因的shRNA载体NS1、NS2、NS3。将构建的shRNA载体和阴性对照分别与表达σC和σNS基因的融合蛋白的真核表达载体pEGFP-σC及pEGFP-σNS共转染DF-1细胞。荧光显微镜观察结果表明,6个shRNA片段不同程度地抑制各自融合蛋白的表达。Real-time PCR检测结果表明,C3和NS1体外干扰病毒复制的效果最佳。
[期刊] 中南林业科技大学学报  [作者] 李蕾蕾  孙丰坤  李晓一  詹亚光  曾凡锁  
糖基转移酶基因是生物分子糖基化中的关键基因,已有研究表明少数糖基转移酶14(Glycosyltransferase14,GT14)家族基因在植物细胞壁合成及对逆境的响应中发挥重要的生物学功能,然而GT14基因对逆境的响应机制目前仍不清楚。为了研究糖基转移酶基因的生物学功能,本实验室在克隆了白桦Bp GT14基因(JQ409354)编码区序列全长的基础上,利用Bam HⅠ单酶切的方法构建了白桦Bp GT14基因的p BI121植物表达载体,并利用一步PCR之后在同一体系中同时酶切-连接的方法,构建了Bp GT14基因RNA干扰载体,相比于传统的RNA干扰载体构建方法更为高效快捷。测序结果表明,植...
[期刊] 西南农业学报  [作者] 王闵霞  张晓东  张志雄  王平  张志勇  蔡平钟  
本研究建立了以水稻叶绿体来源的trnA、trnI为同源重组片段,水稻叶绿体来源的Prrn为启动子,烟草叶绿体来源的Tps-bA为终止子,EPSP为筛选标记基因,GFP为外源基因,并含有两个多克隆位点(MCS)的"水稻通用叶绿体表达载体":pBAC823-NdeI-trnA-ApaI-XhoI-Prrn-AgeI-SalI-GFP-KpnI-SmaI-PacI-tpsba--HindIII-Prrn-EPSP-tpsba-EcoRI-trnI-NotI-pBAC823,并将其命名为pBAC8234。酶切试验结果证明,载体pBAC8234上GFP基因两侧设计的酶切位点为单克隆酶切位点,可用于后续实...
[期刊] 华北农学报  [作者] 杨杰  仲维功  王才林  柳青  王明波  Narayana M.Upadhyaya  
利用RNA干扰原理可以对作物进行遗传改良。构建RNA干扰的发夹结构一般采用在引物两端加酶切位点方法,该方法涉及酶切位点多,步骤繁琐。本试验介绍一种直接利用PCR产物进行RNAi组成型表达载体构建的方法,该载体以潮霉素为筛选标记基因,适合水稻的遗传转化。
[期刊] 西南农业学报  [作者] 呼丽君  柴友荣  张建奎  姚永宏  
二氢黄酮醇-4-还原酶(dihydroflavonol-4-reductase,DFR)是类黄酮途径的一个关键酶,对种皮色泽和花色的形成具有重要作用。本研究从甘蓝型油菜克隆了600 bp(不计人工酶切位点)的芸薹属DFR基因家族的RNA干扰片段BDFRI,将其反义片段和正义片段分别插入到本课题组新近改造的植物RNAi平台载体pFGC5941M的启动子与间隔区之间、间隔区与终止子之间,构建了11 400 bp的RNAi干扰载体pFGC5941M-BDFRI,通过多重PCR鉴定证实载体构建成功,并转化到根癌农杆菌菌株LBA4404中形成了工程菌株。此载体的构建为进一步研究DFR基因参与决定芸薹属种...
[期刊] 林业科学研究  [作者] 车代弟  王海峰  王金刚  龚束芳  樊金萍  
利用简并引物RT-PCR,克隆复叶槭FtsZ基因的cDNA序列,利用马铃薯X组病毒载体pgR107,构建RNA干扰重组病毒载体pVX-AnFtsZi,并转化农杆菌GV3101(含辅助质粒pJIC Sa-rep)侵染烟草。40 d后,检测烟草内源FtsZ基因的表达量。研究结果表明:从复叶槭中克隆到的569bpFtsZ基因cDNA片段,具有FtsZ蛋白的核心功能序列GGGTGSG。构建的hpRNA型RNA干扰载体抑制了FtsZ基因的表达。为培育槭树类彩叶新品种奠定分子理论基础。
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