为防治水稻干尖线虫病提供理论支持,研究了水稻干尖线虫氨基肽酶基因特征,并对其编码蛋白结构与功能进行分析。基于水稻干尖线虫转录组测序,并通过RACE技术,从水稻干尖线虫中克隆得到了一氨基肽酶基因AbAmpep。生物信息学进行基因分析,原位杂交实验进行表达定位分析。该基因CDS序列全长为2 787 bp,含有2个开放阅读框(ORF)。最长开放阅读框(ORF)大小2 661 bp,可编码886个氨基酸,蛋白分子量为101.74 k Da,理论等电点(PI)为5.78。编码蛋白氨基酸序列中具有2个Zn2+结合位点和1个Pep N保守结构域,有特征信号序列TISHELAHFW,属于谷氨酸锌蛋白(Glu ...

根据水稻干尖线虫转录组测序结果，采用ｃ ＤＮＡ末端快速扩增技术（ＲＡｃＥ法）从水稻干尖线虫中克隆到效应因子ＳＰＲＹ同源基因，并将其命名为Ａｂ–ＳＰＲＹＳＥｃ（ＮｃｂＩ登录号为ＫＴ１８８８２０）。该基因全长为２ ０８９ ｂＰ，包含１个１ ９６２ ｂＰ的开放阅读框（ＯＲＦ）。预测蛋白编码６５３个氨基酸，相对分子质量为７２ ００９，理论等电点为４．８２，不稳定指数为４１．５，属于不稳定性蛋白。保守区预测分析结果表明，该蛋白含有ｂ３０２＿ＳＰＲＹ和ｃＴＬＨ ２个保守结构域，属于ＳＰＲＹ超家族。多序列比对分析结果表明，该基因编码蛋白与马来丝虫的ＳＰＲＹ（ＸＰ＿００１８９１９７９．１）蛋白的相似度为４３％．．．

根据转录组测序结果，结合ＲＴ–ＰＣＲ及ＲＡＣＥ技术，从水稻干尖线虫中克隆出翻译控制肿瘤蛋白（ＴｈＥ ＴＲＡｎｓｌＡＴｉｏｎＡｌｌｙ ＣｏｎＴＲｏｌｌＥｄ ＴｕｍｏＲ ＰＲｏＴＥｉｎ，ＴＣＴＰ）基因Ａｂ–ＴＣＴＰ。该基因序列全长８１０ ｂＰ，开放阅读框长度为５４６ ｂＰ，编码１８１个氨基酸，预测蛋白相对分子质量为２０ ９３０，等电点为４．６８；Ａｂ–ＴＣＴＰ蛋白属于稳定性蛋白，没有信号肽和跨膜区域，亚细胞定位于细胞核中；该蛋白功能区域的氨基酸序列较为保守，含有ＴＣＴＰ保守结构域，属于ＴＣＴＰ超家族（ＴＣＴＰ ｓｕＰＥＲｆＡｍｉｌｙ）。多序列比对分析结果表明，Ａｂ–ＴＣＴＰ蛋白与秀丽隐杆线虫ＴＣＴ．．．

【目的】水稻干尖线虫是我国和世界范围内重要的种传病害,为了解我国水稻干尖线虫生产种子带虫现状及其来源。【方法】以改良的贝尔曼漏斗法检测了来自广东、广西、贵州、云南、四川、湖北、安徽、江苏、新疆、宁夏、和吉林等省(区)种子市场的341份水稻生产种种子、40份杂交水稻制种母本,168份水稻品种比较和区域试验材料所携带的干尖线虫。【结果】发现生产种子24 h内干尖线虫检出阳性率为21.11%,其中籼稻阳性率为23.21%,显著高于粳稻11.48%的阳性率(P=0.0427);粳稻阳性样本百粒检出虫量显著高于籼稻

根据水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)PXO99的tatB基因序列设计引物,采用PCR方法从PXO99中克隆了tatB基因,命名为tatBXoo。通过同源重组的方法,构建了tatBXoo的插入突变株TBM,在含有X-gluc的抗性平板上筛选,并经Southern blot杂交验证确认。表型测定结果表明:与野生型相比,tatB突变株在水稻(寄主)上的致病性减弱,但在烟草(非寄主)上仍具有引起过敏反应的能力;tatB突变导致Xoo致病相关的重要表型如胞外多糖减少,游动性及趋化性减弱。但是,tatB突变不影响Xoo在基本培养基(MMX)中正常生长、胞外...

为了探究水稻转氨酶基因Os AMTR310的功能以及明确其作用机制,利用多种分子生物学手段对Os AMTR310基因进行了功能分析。实时定量PCR的分析结果表明,Os AMTR310在干旱条件下相对基因表达水平是正常条件下的3.0倍;根据NCBI上获得的Os AMTR310基因序列设计引物,扩增其全长CDS序列,并利用NCBI对蛋白序列的功能结构域进行预测;将Os AMTR310的CDS序列连入p CAMBIA1302中构建超表达载体,并转入受体材料,通过PCR及蛋白质免疫印迹分析来确定Os AMTR310阳性转基因植株,进而分析Os AMTR310转基因植株与野生型植株在干旱胁迫下的差异来验证Os AMTR310基因的功能。结果表明,Os AMTR310 c DNA全长1 873 bp,CDS全长1 533 bp,编码510个氨基酸。Os AMTR310蛋白具有3个保守的结构域,属于乙酰鸟氨酸氨基转移酶家族。在正常条件下,Os AMTR310转基因植株与野生型相比没有明显的差别;然而,在干旱条件下,Os AMTR310转基因植株的存活率是野生型的1.5~2.0倍。通过测定叶片游离脯氨酸含量发现,Os AMTR310转基因植株游离的脯氨酸含量在正常条件下与野生型相比并无显著差异,而Os AMTR310转基因植株的游离脯氨酸含量在干旱条件下是野生型植株的1.5~2.0倍,说明水稻转氨酶基因Os AMTR310赋予了水稻更高的耐旱性。

【目的】克隆水稻镉（Cadmium，Cd）响应基因OsGLP1-2，并对其进行生物信息学及Cd胁迫处理的表达模式分析，为探索OsGLP1-2基因在水稻中应对重金属胁迫的分子机制提供基础。【方法】以水稻为材料，利用PCR克隆OsGLP1-2基因，并利用生物信息学方法对其顺式作用元件、二级结构和疏水性等进行分析，用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测其在100 μmol/L Cd处理下，水稻茎部和根部中的表达特征，再利用转基因酵母进行Cd耐受性分析。【结果】水稻OsGLP1-2基因编码区（CDS）序列长度为651 bp，编码216个氨基酸，其编码蛋白的相对分子量为22.48 kDa，理论等电点（PI）为7.16，为稳定性的中性疏水性蛋白，含有Cupin结构域，属于Cupin家族，该家族在植物防御等方面发挥着重要作用。同源家族进化树表明该基因是单独的一支，但与大麦HvGER5a的亲缘关系最为接近，表明OsGLP1-2可能具有HvGER5a类似的功能。二级结构分析结果表明该蛋白含有10个β折叠、8个α螺旋和17个无规卷曲结构。并且OsGLP1-2具有光、干旱等环境诱导相关的调节元件以及生长素、赤霉素和茉莉酸甲酯等激素相关调节元件，表明目的基因可能参与水稻对非生物胁迫的响应。100 μmol/L Cd处理下，在6 h时地上部分目的基因的表达水平约为对照组3倍，且地下部分也为对照组的3倍，即OsGLP1-2基因能对Cd产生响应。最后斑点实验表明该基因在酵母中无明显表型。【结论】成功克隆了水稻OsGLP1-2基因，且该基因对Cd有一定的响应，可为水稻应对重金属胁迫的反应机制提供参考依据。

为了深入研究作物耐逆境胁迫的分子机制和发现新的水稻耐逆基因,采用Affymetrix基因芯片技术与水稻表达芯片(含51,279个转录本),分析了培矮64S不同生长发育时期、不同组织器官全基因组在低温、干旱、高温逆境胁迫下的表达水平变化,筛选出一批耐多逆境候选功能基因。OsMsr13是其中一个受低温、高温与干旱诱导,在各生长发育时期与组织器官均显著上调的基因。根据序列生物信息学分析,OsMsr13含有7个外显子和6个内含子c,DNA全长序列为1603bp,完整的ORF为1317bp,编码一个含438个氨基酸残基的蛋白质;在OsMsr13启动子区域发现多个与逆境应答相关的顺式作用元件;数据库查找和...

[目的]克隆并解析水稻叶片融合基因LF1(Leaf Fusion 1)的功能，为阐明水稻叶片发育的分子机制奠定基础。[方法]lf1为水稻品种‘02428’组织培养获得的叶片融合突变体。利用水稻叶片融合突变体lf1与籼稻品种‘N22’构建遗传分离群体，精细定位lf1;结合突变体重测序分析确定候选基因，经基因敲除克隆LF1;分析该基因的表达模式和蛋白的亚细胞定位。[结果]从lf1/N22的F_2群体中，挑选10株突变个体和10株正常个体，将lf1定位在第6染色体上InDel6-6和RM30标记之间；进一步利用256株极端个体，经加密标记，最终将lf1精细定位在标记InDel6-6和RM6818之间约3.2 Mb区间内；通过对野生型‘02428’和lf1进行重测序分析，发现‘02428’与lf1在定位区间的9个基因存在差异，其中6个为转座子基因，1个为表达蛋白基因，1个为假定蛋白基因，1个为NAC转录因子基因Os06g0344900。与野生型‘02428’相比，lf1中Os06g0344900第1外显子存在1个33 bp的缺失，导致11个氨基酸的缺失，据此将该基因确定为LF1的候选基因。利用CRISPR/Cas9技术，获得4个不同类型的敲除株系，均表现出突变体的表型。上述结果表明，Os06g0344900即为目的基因LF1。qRT-PCR分析表明，LF1呈现组成型表达，且在幼穗中表达量最高。亚细胞定位显示LF1定位于细胞核中。[结论]水稻突变体lf1的叶片融合性状由6号染色体的Os06g0344900基因突变所致。该基因的克隆及初步功能分析为解析水稻叶片的发育调控机制奠定了基础。

【目的】水稻根系是与地上部性状和产量密切相关的重要农艺性状。通过鉴定新的水稻根系发育相关基因,为深入解析水稻根系发育遗传机理奠定基础。【方法】从甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate,EMS)诱变的水稻Kasalath突变体库中筛选到1个根系发育缺陷的突变体Osksr7(Oryza sativa kasalath short root7)。通过溶液培养和田间种植,对该突变体进行苗期表型鉴定及成熟期主要农艺性状考察。将Osksr7分别与野生型籼稻Kasalath和粳稻Nipponbare杂交,F2群体进行遗传分析和突变基因的图位克隆,对预测的候选基因进行测序验证。构建由35S启动子驱动OsKSR7的回复载体,通过农杆菌介导转入突变体成熟胚诱导的愈伤组织进行转基因互补验证。【结果】与野生型相比,Osksr7幼苗期的主根、不定根、侧根和根毛的伸长都受到抑制,主根、不定根和侧根的长度分别只有野生型的33%、38.9%和35.3%,但不定根数有显著增加。农艺性状调查发现,Osksr7的株高、穗数、茎秆粗细、结实率、千粒重和剑叶长宽等性状都受到显著影响,其中,穗数和结实率的差异极显著,分别只有野生型的56.3%和37.3%。遗传分析表明,突变体Osksr7和籼稻Kasalath杂交的F1表型正常,F2群体中正常植株与短根突变植株的分离比符合3﹕1,表明突变体Osksr7的突变性状受1对隐性核基因控制;利用SSR和InDel分子标记将突变基因定位在水稻第11染色体上IND1与IND2之间,物理距离约为143 kb的区间。在该区间有25个预测注释基因,候选基因测序比对发现,突变体Osksr7中的一个编码转运蛋白的基因LOC_Os11g24560第一个外显子上ATG后73 bp处的T突变为A,导致编码的第25位氨基酸由色氨酸突变为精氨酸。生物信息学分析表明LOC_Os11g24560是介导蛋白质从内质网(ER)运向高尔基体(Golgi)的COPII有被小泡的SEC23亚基在水稻中的同源基因。RT-PCR表明LOC_Os11g24560的表达水平在野生型和Osksr7突变体中无显著差异,35S启动子驱动的LOC_Os11g24560的回复载体能够使Osksr7突变体的表型回复成野生型,证实Osksr7的表型是由LOC_Os11g24560突变引起。【结论】Osksr7是一个水稻短根突变体,其产量相关的几个重要农艺性状显著受抑制,突变基因为LOC_Os11g24560,编码COPII有被小泡的SEC23亚基,与已报道的水稻根系基因都不等位,是一个新的水稻根系发育调控基因。

[目的]克隆并解析水稻叶片融合基因LF1（Leaf Fusion 1）的功能，为阐明水稻叶片发育的分子机制奠定基础。[方法]lf1为水稻品种‘02428’组织培养获得的叶片融合突变体。利用水稻叶片融合突变体lf1与籼稻品种‘N22’构建遗传分离群体，精细定位lf1；结合突变体重测序分析确定候选基因，经基因敲除克隆LF1；分析该基因的表达模式和蛋白的亚细胞定位。[结果]从lf1/N22的F_(2)群体中，挑选10株突变个体和10株正常个体，将lf1定位在第6染色体上InDel6-6和RM30标记之间；进一步利用256株极端个体，经加密标记，最终将lf1精细定位在标记InDel6-6和RM6818之间约3.2 Mb区间内；通过对野生型‘02428’和lf1进行重测序分析，发现‘02428’与lf1在定位区间的9个基因存在差异，其中6个为转座子基因，1个为表达蛋白基因，1个为假定蛋白基因，1个为NAC转录因子基因Os06g0344900。与野生型‘02428’相比，lf1中Os06g0344900第1外显子存在1个33 bp的缺失，导致11个氨基酸的缺失，据此将该基因确定为LF1的候选基因。利用CRISPR/Cas9技术，获得4个不同类型的敲除株系，均表现出突变体的表型。上述结果表明，Os06g0344900即为目的基因LF1。qRT-PCR分析表明，LF1呈现组成型表达，且在幼穗中表达量最高。亚细胞定位显示LF1定位于细胞核中。[结论]水稻突变体lf1的叶片融合性状由6号染色体的Os06g0344900基因突变所致。该基因的克隆及初步功能分析为解析水稻叶片的发育调控机制奠定了基础。

采用RT-PCR、cDNA末端快速扩增法(RACE),克隆了象耳豆根结线虫生长发育关键基因actin的全长cDNA序列(登录号:KF534787),并与NCBI核酸数据库进行序列比对,结果表明:序列全长1298 bp,包含一个全长1125 bp的开放阅读框ORF,编码375个氨基酸,起始密码子在82位,终止密码子在1207位,与已知的其它物种的actin具有高度的保守性,与马铃薯腐败线虫和松才线虫actin的同源性分别为99.20%和98.67%,与秀丽隐杆线虫、人类相似性分别达到98.67%和97.33%。系统发育分析表明,象耳豆根结线虫actin可能是β-actin,同时也发现了象耳豆根结...

根据Caruorhabditis elegans、C.briggsae和Brugia malayi的her-1基因的保守序列设计引物,从捻转血矛线虫cDNA中扩增出597 bp的DNA片段。以此序列为基础,通过5'RACE和3'RACE技术分别获得该基因的5'端和3'端未知序列。将这些序列拼接后获得捻转血矛线虫Hcher-1基因的全长cDNA,该基因全长1 091 bp,包含一个960 bp的最大开放阅读框(ORF)、67 bp 5'非翻译区和64 bp 3'非翻译区。根据该基因的ORF设计1对特异性引物,以捻转血矛线虫的总RNA为模板,采用RT-PCR技术,扩增出960 bp的DNA片段,序...

根据黄单胞菌hisF基因的同源性设计简并引物,采用PCR方法从水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae,Xoo)中克隆了hisF同源基因,命名为hisFXoo。NCBI网站蛋白质保守结构域搜索表明,HisFXoo属于组氨酸生物合成蛋白家族的一员,具有与其他HisF蛋白相似的结构。序列比较显示,该基因在黄单胞菌中是相对保守的。同源性搜索比较显示,与水稻条斑病菌(X.oryzaepv.oryzicola,Xooc)的hisF(登录号:DQ372107)同源性高达98%。通过同源重组的方法,构建了hisFXoo的插入突变体,在NA+Amp平板上筛选后,并且经过PCR及S...

为了挖掘新的耐逆基因,本文在应用Affymetrix水稻表达芯片分析超级稻亲本培矮64S在不同逆境(高温、干旱、低温)胁迫下、不同发育时期叶片和穗中全基因组表达模式的基础上,对其中一个多逆境响应基因OsMsr11(Oryza sativa L.multiple stressresponsive gene 11)进行了克隆与分析。OsMsr11是一个受低温、干旱、高温多逆境诱导的基因,在孕穗期低温胁迫下表达水平显著上调。通过PCR扩增获得了包含其完整开放阅读框的cDNA序列。序列分析表明,其ORF为234 bp,编码77个氨基酸,有信号肽序列,无典型的保守基因结构域,预测其为分泌通路信号肽,分泌...