【目的】转录因子Oct4、Nanog是调节干细胞多能性相关的转录因子,在干细胞的分化和胚胎发育中有重要作用。本研究旨在克隆水牛Oct4和Nanog基因、分析基因序列和蛋白结构、构建逆转录表达载体,并在水牛体细胞中表达,为进一步研究其在水牛早期胚胎发育中的作用,以及为建立水牛胚胎干细胞系和诱导多能干细胞系(iPSC)奠定基础。【方法】分别从水牛生殖嵴和体细胞中提取RNA和DNA,将RNA反转录成第1链cDNA,参照牛基因序列(Oct4:NM_174580,Nanog:NM_001025344)设计特异性引物,采用RT-PCR和PCR分别扩增Oct4和Nanog的编码区序列(the coding ...

【目的】证实小鼠胎儿成纤维细胞中钙调蛋白(calmodulin,CaM)基因参与热应激诱导型热休克蛋白70(Hsp70)的基因表达并明确其作用条件。【方法】取12.5 d孕鼠胚胎制备成纤维细胞(MEF),上述细胞随机分为对照组和热应激组:对照组在37℃条件下培养,热应激组包括Ⅰ组(39℃、0.5 h),Ⅱ组(39℃、1 h),Ⅲ组(39℃、1.5 h),Ⅳ组(41℃、0.5 h),Ⅴ组(41℃、1 h),Ⅵ组(41℃、1.5 h);每组3个重复。将选择的热应激组和对照组细胞分别加入不同浓度(25、50及100 mmol.L-1)钙调蛋白拮抗剂W7,运用RT-PCR检测Hsp70、CaM mRN...

【目的】克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4(thymosinbeta4,Tβ4)基因,构建皮肤特异性表达载体,转染内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞,筛选出稳定表达红色荧光蛋白并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】通过RT-PCR克隆Tβ4基因cDNA序列,然后与KAP6-1基因启动子片段以及红色荧光蛋白表达元件连接构成Tβ皮肤特异性表达载体pCDsRed-KT。外源表达载体以lipofectamineTM2000介导转染胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合。【结果】克隆了内蒙古白绒山羊Tβ4基因,cDNA全长142bp,其中包含135bp的完整...

为研究IRF-1基因在抗病毒方面的作用,将IRF-1基因转染牛胎儿成纤维细胞,制备了瞬时表达IRF-1基因的转基因细胞,再将携带单股正链RNA的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)作用于上述转基因细胞,观察该病毒在转基因细胞和非转基因细胞上的滴度变化及2种细胞形态、增殖、凋亡和基因表达情况上的差异。结果显示:与非转基因细胞相比,病毒在转基因细胞上滴度显著提高,病毒作用48和72 h后转基因细胞病变程度明显低于非转基因细胞;流式细胞仪检测发现72 h时细胞凋亡率显著降低,荧光定量PCR检测结果显示,转基因细胞中IRF-1基因的表达水平显著提高。结论:IRF-1基因具有促进细胞抗BVDV感染的作用。

【目的】通过建立过表达MyoD1基因山羊胎儿成纤维细胞系研究MyoD1基因的异位表达研究其在成肌分化中的生物作用。【方法】采用RT-PCR从激活的骨骼肌卫星细胞中克隆MyoD1基因,并将其cDNA终止密码子TGA定向突变为GGA,定向克隆至带有增强型水母绿色荧光蛋白(ehanced green fluorescent protein,eGFP)报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,构建融合蛋白表达载体pEGFP-MyoD1,经过酶切、测序鉴定后,采用LipofectiminTMLTX转染山羊胎儿成纤维细胞(goat embryonic fibroblast,GEF)以建立MyoD1异位表达...

【目的】构建绒山羊血管内皮生长因子164(vascular endothelial growth factor 164,VEGF164)基因的毛囊特异表达载体并稳定转染胎儿成纤维细胞,筛选获得稳定表达红色荧光蛋白和毛囊特异表达VEGF164并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】以pCDsRed2载体为基本骨架将VEGF164基因亚克隆到KAP6-1启动子下游,接续连接红色荧光蛋白表达元件,构建VEGF164基因毛囊特异表达载体pCDsRed2-KV(6.3 kb)。外源表达载体以lipofectamineTM2000介导转染胎儿成纤维细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基...

【目的】获得敲除肌肉生长抑制素(MSTN)基因的猪胎儿成纤维细胞。【方法】打靶载体的构建:以Neo为正筛选基因、HSV-tk为负筛选基因。在Neo的两侧分别插入同源长臂和同源短臂。同源长臂5382bp,包含MSTN基因的部分5′端,全部的exon1,intron1和exon2及大部分intron2;同源短臂844bp,包含部分exon3及3′端的部分序列。取35d胎龄的大白猪,用胰酶消化法,分离胎儿成纤维细胞并对其进行培养和建系。采用脂质体法将打靶载体导入胎儿成纤维细胞中,转染后的细胞采用250μg·ml-1G418筛选7d,再用200μg·ml-1G418+2μmol·L-1GANC维持筛选...

【目的】建立适合的牛胚胎干细胞培养环境,保持其未分化状态,保证细胞的全能性。【方法】分别培养小鼠胎儿成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)和牛胎儿成纤维细胞(bovine embryonic fibroblast,BEF),用丝裂霉素C处理两种成纤维细胞分别计数后按1﹕0、1﹕1、2﹕1、1﹕2和0﹕1的比例制成混合饲养层,观察牛胚胎干细胞的生长状态,并对生长在混合饲养层上的牛胚胎干细胞进行碱性磷酸酶,OCT4和SSEA-1免疫组化检测,OCT4、SOX2、NANOG mRNA表达RT-PCR检测、体外分化形成拟胚体等试验。【结果】①生长在混合饲养层上的牛胚...

目的克隆、分析水牛朊蛋白(prionprotein,PrP)成熟片段基因,并获取纯化的表达产物。方法将应用PCR技术扩增的水牛成熟PrP的核酸序列克隆到表达载体pET-32a,并分析其序列;把阳性克隆质粒pET-32a-BPrP转化表达菌BL21(DE3),鉴定纯化的表达产物。结果水牛朊蛋白成熟片段核酸序列及其推导的氨基酸序列与已知其他牛科动物的成熟PrP核酸、氨基酸序列间的相似性分别在97.1%和97.2%以上,并且发现水牛成熟PrP有5个重复序列,编码的氨基酸序列其中有2个九肽和3个八肽重复序列。具有较高的表达水平的PrP融合蛋白被纯化后,用Western印迹实验证明该蛋白具有PrP抗原活...

为探究茶多酚(Tea polyphenols,TP)对体外培养鼠胎儿成纤维细胞(Mouse embryonic fibrolast,MEF)凋亡的影响。在MEF细胞培养液中添加质量浓度为0、10、40、70、100和150μg/mL的TP,分别培养24、48、72和96h,使用MTT法(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,噻唑蓝,MTT法)检测细胞活力;细胞培养72h,以RT-PCR检测B-细胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因(B cell lymphoma leukemia-2,Bcl-2)、和Bcl相关的蛋白X(Bcl-as-sociated X protein,Bax)、...

【目的】为了优化外源多能性转录因子oct4、sox2、klf4、c-myc的mRNA转入山羊胎儿成纤维细胞(goat embryonic fibroblast,GEF)的条件,本试验针对转染试剂脂质体2000和转染方法进行研究。【方法】采用胰酶消化法,从山羊胎儿腿部肌肉组织中分离并获得了纯化的GEF细胞。根据m MESSAGE m MACHINE?T7 Ultra Kit试剂盒说明书,体外转录步骤主要有:1前期的质粒准备:首先用质粒小提试剂盒对摇菌获得的各体外转录载体质粒进行提取,随后对各体外转录载体目的基因下游进行单酶切,获得线性化质粒,最后用DNA纯化试剂盒对线性化的质粒进行纯化...

【背景】随着生物技术发展,研究的生理机制和生物功能日益复杂,提高大载体的转染效率对多基因共表达系统、基因编辑技术、转基因育种等具有重要的意义。在转基因育种中,使用的转基因载体相对较大,而且转基因动物的制备效率也与供体细胞猪胎儿成纤维(porcine Fetal Fibroblasts,PFFs)细胞的转染效率有关。【目的】研究主要从转染参数、质粒用量和拓扑结构三方面,比较3种电转仪ECM~?830/NEPA21/Nucleofector~(TM)2b的大载体转染效率,以探索大载体转染PFFs的最佳条件。【方法】使用3种不同电转仪将长达26 kb的携带增强型绿荧光蛋白基因的pPXAT-EGFP质粒转染1×10~6个PFFs,48 h后使用流式细胞仪测定荧光细胞比例,从电转参数、质粒用量和拓扑结构三方面分别比较瞬时转染效率。【结果】首先比较电转仪不同参数的转染效率,结果显示当电转参数为脉冲电压300 V,脉冲长度1 ms,脉冲间隔50 ms,脉冲次数3次,NEPA 21转染PFFs的效率最高,为13.24%±1.63%,而Nucleofector~(TM) 2b的最佳电转参数为U-023,其转染效率高达46.36%±3.95%。然后在最佳电转参数下分别比较6、8、10和12μg的26 kb超螺旋质粒的转染效率,ECM~?830和Nucleofector~(TM) 2b转染PFFs的最佳质粒用量为12μg,其转染效率分别为8.44%±0.90%(电转参数:脉冲电压300 V,脉冲长度1 ms,脉冲次数3次)和14.63%±3.21%(电转参数:U-023),而NEPA 21使用10μg质粒转染PFFs时效率达到最高(6.09%±0.72%)。最后比较不同质粒拓扑结构的转染效率,结果显示线性化质粒的转染效率较低,仅为超螺旋质粒转染效率的34.96%—48.39%。【结论】因此Nucleofector~(TM) 2b转染PFFs的最佳条件为:U-023程序、12μg超螺旋质粒;NEPA 21为:脉冲电压200 V,脉冲长度3 ms,脉冲间隔50 ms,脉冲次数3次、10μg超螺旋质粒;ECM~?830则在脉冲电压300 V,脉冲长度1 ms,脉冲次数3次条件下转染12μg超螺旋质粒可获得最佳转染效率。综合比较上述3种电转仪,26 kb大载体转染PFFs的最佳电转仪是Nucleofector~(TM) 2b。

[目的]本文旨在利用Cas9蛋白/sgRNA体系，提高猪胎儿成纤维细胞的基因组编辑效率，为促进CRISPR/Cas9技术在猪上的广泛应用奠定基础。[方法]针对猪ROSA26位点的启动子区（包含第一外显子区）设计两条sgRNAs，并将其构建在PX459-Cas9-puro质粒上，以获得PX459-Cas9-sgRNA质粒。将sgRNA靶序列连同PAM序列构建在RGS-CR质粒上，以获得RGS-sgRNA质粒。使用PX459-Cas9-sgRNA质粒与RGS-sgRNA质粒系统共转染，筛选切割效率较高的一条sgRNA，并使用该sgRNA对猪胎儿成纤维细胞进行后续打靶实验。分别使用PX459-Cas9-sgRNA质粒和Cas9蛋白/sgRNA两种方法对猪胎儿成纤维细胞的靶位点进行基因敲除，将转染后的细胞提取基因组DNA，桑格尔测序检测打靶效率。[结果]成功构建了打靶猪ROSA26靶序列的PX459-Cas9-sgRNA质粒，及含PAM序列的RGS-sgRNA，且质粒测序结果显示序列插入正确；RGS-sgRNA筛选结果表明，sgRNA2的打靶效率极显著高于sgRNA1 (P < 0.01)，且sgRNA2无脱靶效应，因此后续使用PX459-Cas9-sgRNA2和Cas9蛋白/sgRNA2在猪胎儿成纤维细胞中进行打靶，并比较两者的打靶效率。在猪胎儿成纤维中，PX459-Cas9-sgRNA2质粒的打靶效率为16.67%，Cas9蛋白/sgRNA2体系的打靶效率为33.33%；[结论]Cas9蛋白/sgRNA体系较PX459-Cas9-sgRNA质粒提高了打靶效率约1倍，这对提高后续猪体细胞的基因敲入效率、促进基因编辑在猪上的应用有重要意义。

采用RT-PCR法对海兰鸡MyoD全长cDNA序列进行扩增,克隆、测序后,构建真核表达载体pEGFP-N1-MyoD,脂质体瞬时转染鸡胚成纤维细胞,用荧光显微镜、RT-PCR和SDS-PAGE电泳法检测MyoD蛋白表达情况。结果表明,构建的真核表达载体pEGFP-N1-MyoD能成功转染鸡胚成纤维细胞;荧光显微镜观察可见绿色荧光;RT-PCR可见目的条带;SDS-PAGE电泳证明表达的蛋白相对分子质量为33KD,该结果为研究MyoD蛋白的功能奠定了试验基础。

以版纳微型猪近交系妊娠47d的胎儿为材料,采用胰蛋白酶消化法消化培养胎儿成纤维细胞,对其进行细胞形态观察、细胞冻存前和复苏后存活率测定、生长曲线绘制和染色体核型分析等生物学特征检测.结果表明,培养的版纳微型猪近交系胎儿成纤维细胞呈典型的成纤维细胞形态;细胞冻存前和复苏后的存活率分别为98.06%和92.12%;生长曲线呈"S"形,倍增时间为36h;对所制备染色体核型进行分析,显示2n=38,XY,并在体外培养14个代次后仍能保持正常核型.