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[期刊] 实验技术与管理
[作者]
付小花 张娴 乐毅全 唐贤春 王磊
为不断完善环境微生物学实验课程建设,培养学生的实际样品分析能力,设计了一套检测水样中大肠菌数的实时荧光定量PCR(pdymerase chain reaction)实验。教学实践表明,实验方案切实可行,学生完成情况良好,学生了解并践行了实时荧光定量PCR技术检测环境样品中的大肠菌数的方法,切身体会到新实验技术的简便性与灵敏性,提升了学生的学习兴趣与创新能力。
[期刊] 实验技术与管理
[作者]
章先 王继璇 谢珲 时玉菲 李肖梁
该文将科研项目成果与医学专业实验教学相结合，在病原生物学与免疫学实验教学中设计了“纳米颗粒在金葡菌A型肠毒素检测中应用”的综合实验项目。基于酶联免疫原理，通过制备纳米磁珠-抗体复合物和纳米金-辣根过氧化物酶（HRP）双标记抗体，提高检测灵敏度。纳米磁珠-抗体可在外磁场的作用下实现目标物质的快速富集和分离，纳米金-辣根过氧化物酶形成的多聚HRP可提升催化效果。单克隆抗体分别标记后与待测的金葡菌A型肠毒素混合反应，形成夹心复合物，通过底物四甲基联苯胺（TMB）的显色进行定量分析。与常规夹心ELISA比，该方法方便快捷、灵敏度高，有助于加深学生对酶标记和免疫检测技术的掌握，激发其科研兴趣。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
胡慧 段志刚 崔保安 张龙现 陈雅君 陈丽颖 张红英 彭新然 孟振北 王亚宾
【目的】建立一种快速检测动物源大肠埃希菌O157∶H7及其毒力基因的多重PCR方法。【方法】以编码大肠埃希菌O157抗原的rfbE基因、编码H7抗原的fliC基因以及编码细胞溶血素A的hylA基因为靶基因,设计3对特异性引物,优化并建立检测大肠埃希菌O157∶H7的多重PCR方法,对其特异性和敏感性进行检测,最后对其临床应用效果进行了初步验证。【结果】成功建立了快速检测和鉴定动物源大肠埃希菌O157∶H7rfbE、fliC和hylA基因的多重PCR方法,该方法特异性较好,灵敏度较高,可达2.0×102CFU/mL。【结论】初步建立了检测动物源大肠埃希菌O157∶H7的多重PCR方法,该方法可用...
[期刊] 华北农学报
[作者]
陈雅君 胡慧 段志刚 崔保安 张龙现 孟振北 彭新然 陈丽颖 王亚宾
为建立快速、特异的分离鉴定大肠杆菌O157∶H7的多重PCR方法,根据GenBank上已发表的大肠杆菌O157∶H7菌体抗原和鞭毛抗原的基因序列(rfbE和fliC基因)设计2对特异引物,分别建立针对rfbE、fliC基因的单一PCR方法;通过优化扩增条件,进一步建立可用于动物粪便检测的大肠杆菌多重PCR方法,并进行特异性和灵敏性试验,同时还初步应用到临床样品的检测中。结果表明:所建立的多重PCR方法能同时扩增出rfbE基因(327 bp)和fliC基因(247 bp)的特异性片段,特异性结果显示其他非大肠杆菌O157∶H7的扩增结果均为阴性,表明该方法有较高的特异性;灵敏度试验结果显示细菌纯...
[期刊] 实验技术与管理
[作者]
章先 王继璇 丁伟勇 谢珲 时玉菲 李肖梁
结合临床实际检测需求和免疫标记领域研究热点，设计了基于量子点阳离子交换反应检测金葡菌A型肠毒素的综合性实验，用于医学专业病原生物学与免疫学实验教学。利用量子点修饰金葡菌A型肠毒素单克隆抗体，制备了单克隆抗体-量子点荧光标记物，并优化了基于阳离子交换反应的量子点信号检测体系，最终应用于金葡菌A型肠毒素免疫学检测方法的建立。实验结果显示，所建立的基于量子点阳离子交换反应的金葡菌A型肠毒素免疫学检测法灵敏度高、特异性好。该综合性实验将相关理论原理与技术创新相结合，加深了学生对免疫标记与检测技术教学内容的理解，提高了专业操作技能，激发了科研兴趣。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
张雪寒 张碧成 栾晓婷 汪伟 周俊明 何孔旺
肠出血性大肠杆菌(Enterohaemorrhagic E.coli,EHEC)O157:H7是重要的食源性病原菌,导致严重的人兽共患病。本文旨在建立以Z0372基因为靶基因的PCR检测技术,特异性检测EHEC O157:H7。以Z0372基因为靶序列,设计引物,建立Z0372-PCR,分析敏感性、特异性,并检测模拟阳性污染样品。结果表明,Z0372-PCR对纯培养物检测限103~104CFU/m L,模拟阳性污水样和肉样,增菌后检测限10~102CFU/m L(g)。非大肠杆菌O157和其他肠道病原全部为阴性扩增,只有肠出血性大肠杆菌O157:H7扩增出清晰而特异的条带。模拟阳性样品检测,条...
[期刊] 华北农学报
[作者]
陈利达 袁军海 李磊 石延霞 柴阿丽 谢学文 李宝聚
为了建立一种快速检测镰孢菌属的方法。根据Fusarium翻译延伸因子(TEF-1α)基因序列,设计并筛选其特异性引物F8-1/F8-2,能从靶标基因组DNA中特异性扩增出大小为187 bp的目的片段,建立Fusarium荧光定量PCR(RT-PCR)检测体系的灵敏度比常规PCR高104倍,且特异性良好。利用该反应体系检测不同湿度环境下病残体和土壤病残体DNA含量的动态变化。结果表明:病残体及土壤病残体DNA初始拷贝数分别为6. 90×10~(11),1. 06×10~(12)拷贝数/g,经过温度27℃、80%湿度下处理30 d病残体DNA含量下降至5. 55×10~8和0拷贝数/g,而在温度27℃、20%湿度下含量分别为8. 04×10~9,1. 30×10~9拷贝数/g。因此,建立的Fusarium实时荧光定量PCR检测体系具有特异性强、灵敏度高的特点,可以快速准确地定量检测病残体DNA的含量,为瓜类根腐病的早期预防和流行监测提供了有效的技术手段。
关键词：
镰孢菌 实时荧光定量PCR 湿度 病残体
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李建科 冯再平 仇农学
【目的】研究苹果浓缩汁中耐热菌(Alicyclobacillusacidoterrestris)的定量PCR快速检测法。【方法】通过引物设计、PCR扩增及凝胶纯化试剂盒回收,构建并获得耐热菌的PCR竞争模板;用获得的竞争模板作为定量内标物建立耐热菌的竞争定量PCR(QC-PCR)检测体系。【结果】经对建立的QC-PCR检测体系优化,目标模板检测灵敏度由5×104个分子/PCR体系,提高到50个分子/PCR体系,竞争模板和目标模板分子共扩增可检测到5×102个目标模板分子/PCR体系,并能从人工回添苹果浓缩汁样品中定量检测到5×103cfu/PCR体系的耐热菌,整个检测时间为4～5h,比传统的细...
关键词：
耐热菌 苹果浓缩汁 竞争定量PCR
[期刊] 海洋水产研究
[作者]
刘宗晓 刘荭 史秀杰 高隆英 岳志芹 吕建强 何俊强 江育林 谢从新
选取杀鲑气单胞菌A层A蛋白(VapA)保守序列,利用Primer Express 2.0软件设计引物和探针。以ATCC标准株10倍系列稀释,通过血球计数板计数后进行实时定量PCR,制作标准曲线。通过SDS软件获得细菌数量(X)与Ct值的关系为:Ct=-3.1574lgX+43.6841(相关系数R2=0.992)。实时定量PCR的检测限为6个细菌。建立的方法对杀鲑气单胞菌典型株和非典型株具有较好的特异性,与其他细菌没有交叉反应。杀鲑气单胞菌实时定量PCR方法的建立,对于快速口岸检疫、临床诊断和疫病监测具有重要的应用价值。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
王娟芳 戴建君 姜敏 任建鸾 李德志 张鹏 孙建和 汤芳
[目的]本试验旨在建立一种能同时检测禽致病性大肠杆菌O_1、O_2和O_(78) 3种血清型的三重PCR检测方法。[方法]根据O_1、O_2和O_(78) 3种血清型的特异性基因片段设计并合成引物,分别提取O_1、O_2和O_(78)血清型禽致病性大肠杆菌的DNA作为模板,优化三重PCR反应条件,进行特异性和敏感性检测,并对临床模拟样品进行检测。[结果]在三重PCR的25μL反应体系中,dNTP 1.5μL,MgCl_22.5μL,Taq DNA酶0.6μL,O_1、O_2、O_(78)最佳引物加入量分别为0.6、0.2、0.6μL;最佳退火温度为55.9℃。三重PCR的特异性好,3种血清型之间无交叉反应;对146株不同血清型的大肠杆菌进行检测,准确率为99.32%(145/146),用金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和枯草芽胞杆菌进行特异性检测时,没有出现非特异性扩增。三重PCR敏感性高,以单一血清型DNA为模板时,O_1和O_2血清型的DNA最低检测限均为0.1 ng·μL~(-1),O_(78)血清型的DNA最低检测限为0.02 ng·μL~(-1);以O_1、O_2和O_(78)混合DNA为模板时,最低检测限为0.05 ng·μL~(-1)。对18份临床模拟样品进行检测,准确率为94.4%(17/18)。[结论]建立了一种能同时检测O_1、O_2和O_(78)3种血清型禽致病性大肠杆菌的三重PCR方法,方法特异性好,敏感性高,适用于临床上禽大肠杆菌病的快速检测。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
刘珍 张庆利 万晓媛 马芳 黄倢
根据Ｇｅｎ Ｂａｎｋ中公布的虾肝肠胞虫（ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｏｚｏｏｎ ｈｅｐａｔｏｐｅｎａｅｉ）（ｅｈｐ）ＳＳＵ ｒ Ｄｎａ序列设计１对特异性引物，建立并优化了ｅｈｐ的ＳｙＢｒ Ｇｒｅｅｎ ｉ实时荧光定量ｐｃｒ（ｑ ｐｃｒ）检测方法。结果显示，该方法在６０℃的退火温度时扩增效果最好，产物的熔解曲线为１个单峰，构建的方法对８．３×１０１–８．３×１０８ ｃｏｐｉｅＳ／μｌ的ｅｈｐ ＳＳＵ ｒ Ｄｎａ片段的检测响应具有良好的线性关系，扩增产物阈值循环数（ｃｔ）与模板起始量的对数［ｌｏＧ（Ｓｑ）］的关系为ｃｔ＝–３．３６９ ｌｏＧ（Ｓｑ）＋３９．３６４（ｒ２＝０．９９２），扩增效率为９８．１％，检测．．．
[期刊] 中国农业科学
[作者]
吕殿红 蒋红霞 曾振灵 陈杖榴
【目的】对大肠杆菌AcrAB外排泵系统acrA、acrB基因进行原核表达,获得的表达产物AcrA、AcrB蛋白分别免疫兔,制备相应的抗体,建立大肠杆菌外排泵表达水平的ELISA检测方法。【方法】扩增AcrAB外排泵系统acrA、acrB基因片段,扩增片段分别与原核表达载体pET-41a(+)连接构建重组质粒,于BL21(DE3)中进行诱导表达。表达产物AcrA、AcrB纯化后分别免疫新西兰大白兔,获得抗AcrA、AcrB抗血清,并用Western blot方法对表达产物进行鉴定分析。纯化的AcrA、AcrB蛋白分别按不同的浓度包被酶标板,与不同稀释倍数的抗血清反应,通过ELISA检测确定最佳抗...
[期刊] 华北农学报
[作者]
杜向党 焦显芹 莫娟 张素梅 侯春彬 李新生
为了解河南地区鸡猪源CTX-M型超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的流行情况,并进行基因型分析,通过表型确证试验检测产ESBLs大肠杆菌,分别用5组CTX-M型引物对其进行聚合酶链式反应扩增。表型确证试验检测结果显示,鸡、猪源大肠杆菌中产ESBLs菌株检出率分别为62.8%(59/94)和78.3%(36/46)。PCR扩增结果进一步显示,鸡源大肠杆菌中CTX-M型ESBLs阳性率为89.8%(53/59),其中CTX-M-2组型14株,CTX-M-9组型26株,CTX-M-2和CTX-M-9组型13株;猪源大肠杆菌CTX-M型ESBLs的阳性检出率为69.4%(25/36),其中,CTX-M-...
关键词：
大肠杆菌 耐药 CTX-M
[期刊] 中国农业科学
[作者]
庄娜 陈雪影 岳磊 廖晓萍 刘雅红
【目的】检测分离自广东省散养型养殖场的动物源大肠杆菌中oqxAB基因及其它质粒介导喹诺酮类耐药基因(PMQR)的流行情况。【方法】采用PCR方法检测oqxA、oqxB、qnr、qepA和aac(6′)-Ib-cr基因;琼脂平板稀释法对PMQR阳性菌株进行18种抗菌药物的最小抑菌浓度测定。【结果】qnrB、qnrS、aac(6′)-Ib-cr、oqxA、oqxB的检出率依次为10.49%、18.88%、31.47%、44.8%和48.9%,但未检测到qnrA、qnrC、qnrD和qepA。oqxA与oqxB的检出率较高,且oqxA与oqxB常常同时存在。多数菌株同时携带两个或两个以上的PMQR基...
[期刊] 实验技术与管理
[作者]
张丽丽 陈真 刘雨轩 蔡健楠
印刷电路板（PCB）检测方法对于确保产品正常工作至关重要。该文针对传统的人工检测方法易存在漏检、误检等问题，采用深度学习方法对PCB缺陷进行检测，并搭建了基于ZYNQ的硬件实现平台；采用软硬件协同设计方法，使用FPGA对算法进行了硬件加速，其中包括采用了YOLOv3-SPP网络模型，并对该结构进行了优化，使其适用于ZYNQ端的部署。在搭建硬件平台时，首先通过Vivado配置硬件基本信息，然后使用Peta Linux创建Linux系统，在Vitis中调用该系统并添加DPU IP核，最后在ZYNQ的PS端采用多线程思想编写Python程序，实现PCB缺陷的检测。实验结果显示，该系统对各类型PCB缺陷的检测精度均在0.95以上，检测精度平均值（m AP）为0.97。
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