【背景】禾谷镰孢（Fusarium graminearum）是引起小麦赤霉病（Fusarium head blight）的主要病原真菌，侵染后导致作物品质和产量下降，同时产生多种真菌毒素，严重危害粮食生产和人类健康。氧酰基载体蛋白还原酶（3-oxoacyl ACP reductase,OAR1）催化羧酰基载体蛋白还原成氧酰基载体蛋白，在脂肪酸的生物合成过程中具有重要作用。【目的】构建FgOAR1基因缺失突变体，研究其表型、显微结构、孢子产量、有性生殖和致病力等的变化，探究FgOAR1的生物学功能，揭示其对禾谷镰孢生长、发育和致病的影响，为新型抑菌作用靶点的筛选及小麦赤霉病的防控提供科学依据。【方法】以禾谷镰孢野生型菌株PH-1为材料，应用Split-Marker基因敲除技术，构建FgOAR1基因缺失突变体（ΔFgOAR1),Gap-repair技术获得缺失基因的回补突变体（ΔFgOAR1-C）；将PH-1、ΔFgOAR1和ΔFgOAR1-C菌株分别接种到常规培养基，观察菌落表型变化并测定脂肪酸含量差异；接种到含刚果红（Congo-Red）、SDS、NaCl和H_2O_2的压力筛选培养基中，观察菌丝在压力培养条件下的生长状况；接种CMC培养基，比较分生孢子产量差异；接种胡萝卜培养基，观察有性生殖及孢子性状；分别进行小麦胚芽鞘和穗部接种，统计发病率和毒素产量，比较突变体与野生型菌株的致病力差异。【结果】与野生型PH-1菌株相比，在PDA、YEG和CM培养基中ΔFgOAR1突变体未呈现明显表型变化，在0.7 mol·L~(-1) NaCl、0.03%H_2O_2、0.01%SDS和300μg·m L~(-1)Congo-Red等压力培养条件下，突变体菌落直径显著低于野生型PH-1，表明FgOAR1与禾谷镰孢细胞膜和细胞壁的合成相关；ΔFgOAR1突变体在液体培养基中的分生孢子产量（8.1×10~5个/mL）显著低于PH-1(1.26×10~6个/mL），接种小麦胚芽鞘和麦穗后，ΔFgOAR1突变体的致病力显著低于野生型菌株PH-1。【结论】禾谷镰孢中FgOAR1参与脂肪酸的生物合成，对细胞膜合成具有重要作用，该基因缺失导致突变体抗逆性降低，分生孢子产量下降，且致病力显著降低，FgOAR1对禾谷镰孢的生长、发育和致病具有重要作用。

【目的】Abp1作为肌动蛋白结合蛋白家族成员之一,在各种真核生物肌动蛋白骨架形成过程中具有核心作用。本研究旨在分析禾谷镰孢(Fusarium graminearum)中肌动蛋白结合蛋白FgAbp1在生长发育、对新型杀菌剂氰烯菌酯敏感性以及毒素体形成等生物学过程中的功能。【方法】利用融合PCR和酵母空隙修复技术分别构建FgAbp1基因敲除打靶片段和融合荧光蛋白载体,再通过聚乙二醇介导的原生质体转化的方法获取基因缺失突变体ΔFgAbp1和荧光标记菌株。观察比较野生型PH-1、突变体ΔFgAbp1和回补体ΔFgAbp1-C的菌丝生长、有性生殖以及无性繁殖,并测定基因敲除突变体ΔFgAbp1对杀菌剂氰烯菌酯的敏感性。通过融合绿色荧光蛋白,明确FgAbp1在菌丝中的分布情况;利用透射电子显微镜观察分析FgAbp1对细胞中液泡/囊泡形态的影响。在非产毒环境和诱导产毒条件下,通过双荧光共定位分析FgAbp1在禾谷镰孢毒素体形成过程中的作用。【结果】禾谷镰孢中,FgAbp1主要呈颗粒状定位于近细胞膜处。在MM培养基中,基因敲除突变体ΔFgAbp1的生长速率与野生型相比降低了15%,但在营养丰富的CM中ΔFgAbp1的生长速率却减慢了38%。突变体ΔFgAbp1在无性繁殖以及有性生殖过程中相较野生型没有明显缺陷。然而在0.5μg·mL~(-1)氰烯菌酯的作用下,ΔFgAbp1的菌丝生长完全受到抑制,并且分生孢子萌发率显著下降。此外,敲除基因FgAbp1导致细胞中液泡不能正常形成且囊泡增多。在非产毒条件下,FgAbp1与DON毒素合成关键酶Tri1共定位于囊泡中;在诱导产毒条件下,FgAbp1与Tri1则共定位于毒素体中。此外,敲除基因FgAbp1会导致毒素体不能正常形成。【结论】肌动蛋白结合蛋白FgAbp1在禾谷镰孢营养生长、发育、氰烯菌酯敏感性以及毒素体形成过程中发挥着重要作用。

【背景】假禾谷镰孢（Fusarium pseudograminearum）引起的小麦茎基腐病是我国小麦生产上的新病害。自噬是真核生物中普遍发生的细胞过程，调控多种植物病原真菌的生长发育和侵染，但其在假禾谷镰孢中的作用还不明确。【目的】明确假禾谷镰孢自噬相关基因FpAtg3在该病菌生长和致病中的作用，解析假禾谷镰孢致病机理，为小麦茎基腐病科学防控提供理论依据。【方法】从NCBI数据库中下载主要真菌的Atg3氨基酸序列，利用MEGA5.05构建系统进化树。利用Split-PCR策略构建FpAtg3基因敲除盒，经PEG介导的原生质体转化导入假禾谷镰孢野生型菌株中。利用潮霉素抗性筛选阳性转化子，并经PCR检测获得FpAtg3基因缺失突变体（ΔFpAtg3）。构建pKNTG-FpAtg3重组载体，导入ΔFpAtg3菌株，利用FpAtg3自身启动子启动FpAtg3的转录，以获得FpAtg3缺失突变体的回补菌株。利用假禾谷镰孢营养生长的培养基PDA、CM和MM测定菌丝生长速率和菌落形态；PDA培养基上测定菌丝形态和菌丝融合率；CMC培养液中测定分生孢子的产量及形态；皮氏培养基上测定孢子融合芽管调控的融合率。将假禾谷镰孢的菌丝块接种小麦胚芽鞘和大麦叶片测定病原菌的致病力，采用盆栽试验测定假禾谷镰孢引起的小麦茎基腐病。在PDA培养基中分别加入刚果红、SDS和过氧化氢测定假禾谷镰孢对细胞壁、细胞膜和氧化胁迫的耐受性。【结果】细胞自噬相关蛋白Atg3在真菌中非常保守，且与生物进化的方向一致，假禾谷镰孢FpAtg3与禾谷镰孢和尖镰孢的Atg3同源性最高。获得了FpAtg3基因缺失突变体和回补菌株，表型测定结果显示，与假禾谷镰孢野生型和回补菌株相比，ΔFpAtg3在营养培养基上的菌丝生长明显减慢，气生菌丝减少，菌丝呈波纹状卷曲，分生孢子产量减少，孢子变短，分生孢子分隔减少；野生型和回补菌株菌丝融合发生非常普遍，在相同条件下ΔFpAtg3的菌丝融合率和孢子融合芽管调控的融合率均明显降低；ΔFpAtg3侵染大麦叶片和小麦胚芽鞘造成的病斑较野生型和回补菌株侵染的病斑明显减小，盆栽试验进一步验证ΔFpAtg3的致病力降低；与野生型和回补菌株相比，ΔFpAtg3在刚果红、SDS和过氧化氢胁迫中的耐受性降低。【结论】自噬相关基因FpAtg3参与假禾谷镰孢的菌丝生长、分生孢子产生、菌丝融合、致病力以及对非生物胁迫的耐受性。

Tri12是镰孢菌Fusarium编码单端孢霉烯族毒素(trichothecenes,以下简称“单族毒素”)输出泵的基因,而产毒基因Tri5编码的单端孢霉二烯合酶催化毒素生物合成中的第一步反应。以禾谷镰孢FusariumgraminearumSchw.野生型菌株NRRL29169为亲本,获得Tri12敲除的转化子MT12。与NRRL29169相比,MT12在PDA培养基上生长慢,生长量小(P<0.01),大分生孢子较长。致病力测定结果显示,NRRL29169致病力最强,所致病害可以自接种点向上下扩展至其他小穗,而MT12的致病力极弱。我们由此推测,Tri12的敲除导致病菌产生的毒素不能被泵出体...

硬脂酰－酰基载体蛋白脱饱和酶是植物脂肪酸合成代谢的关键酶，直接调节膜脂和贮脂中饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的比例。本研究通过ＲＴ－ＰＣＲ及ＲＡＣＥ技术，克隆乌桕硬脂酰－酰基载体蛋白脱饱和酶（ＳＳＳＡＤ）的ＣＤＮＡ全长序列。结果显示，该序列包含１个１１９１ ｂＰ的完整的开放阅读框（ＧＥＮｂＡＮｋ登录号为ＥＦ０７９６５５），编码３９６个氨基酸，含３３个氨基酸的叶绿体转移肽。其成熟肽含有３６３个氨基酸，推测其分子量为４１．５ ｋＤＡ，等电点为５．４２。同源性分析及同源建模数据显示ＳＳＳＡＤ和其它物种的ＳＡＤ有较高的同源性，含有１个保守结构域。构建原核表达载体ＰＭＡＬ－ＳＳＳＡＤ，转入大肠杆菌ＤＨ５α，并．．．

小麦穗期接种禾谷镰孢FusariumgraminearumSchw . [有性态 :Gibberellazeae (Schw .)Petch]的 2个野生型菌株和12个产毒潜能不同的转化体菌株 ,发病盛期 (接种后 2 0d)调查病小穗率 ,并测定组织中脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (DON)、15 乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (15 ADON)和 3 乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (3 ADON)等单端孢霉烯族毒素 (以下简称“单族毒素”)的含量。结果显示 ,菌株间致病力存在显著差异。强致病力的GZ36 39、C11 1和B4 1等菌株在病穗 (显症 )组织和穗颈组织中DON产量高 ,分别达 2 9～ 3...

以拟南芥酰基载体蛋白为查询序列,检索18个植物物种的基因组数据库,获得138个酰基载体蛋白基因和12个基因片段。植物酰基载体蛋白由1个基因家族编码,成员2～16个。植物酰基载体蛋白磷酸泛酰巯基乙胺结合位点(Ser)周围的氨基酸序列高度保守,该位点包含在保守的DSL基序中。植物酰基载体蛋白基因结构类型分为5种,其中类型III酰基载体蛋白基因所占比例最大。绝大多数植物酰基载体蛋白基因家族成员单独或2～4个成员分布在一条染色体上。在138个植物酰基载体蛋白基因中,19个具有不同剪接体。植物酰基载体蛋白基因家族成员可能起源于一个共同的祖先基因。

以苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种(Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki)8010为研究材料,通过PCR技术获得Bt 8010菌株NAD(P)H:醌氧化还原酶基因上下游2个片段,以含有卡那霉素抗性基因的pDG780质粒为中间载体,通过酶切、连接和PCR,构建含待敲除NAD(P)H:醌氧化还原酶基因上下游片段、卡那霉素抗性基因的重组质粒pRN5101DKU,为后续Bt8010菌株NAD(P)H:醌氧化还原酶基因的敲除做准备.

分别扩增了禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)对多菌灵(MBC)敏感菌株(MBCS)的β1-微管蛋白基因(β1-S)和β2-微管蛋白基因(β2-S),及多菌灵中抗菌株(MBCMR)和高抗菌株(MBCHR)的β2-微管蛋白基因(β2-MR和β2-HR),测序正确后连接到pET32a(+)原核表达载体上,转化至大肠杆菌Rosepta感受态中,经IPTG(1 mmol.L-1)诱导,得到了N末端融合6×His纯化标签的表达产物。SDS-PAGE电泳分析表明:在大肠杆菌中表达了相对分子质量约68×103的蛋白,和预测蛋白大小一致,表达的产物主要以包涵体的形式存在。表达的蛋白经HisT...

【目的】明确灰葡萄孢BcKMO在病菌生长、发育和致病过程中的功能,为阐明该基因调控灰葡萄孢生长、发育和致病的分子机理奠定基础,并为灰霉病的防治提供理论依据。【方法】利用生物信息学方法,对BcKMO及其编码产物进行分析。扩增BcKMO的编码区,与pBARKS1-eGFP载体连接,构建基因的表达载体pBARKS1-BcKMO-eGFP;利用PEG介导的原生质体转化方法,转化BcKMO的T-DNA插入突变体BCG183的原生质体;利用PCR、Southern blotting和real-time PCR技术,对所获得转化子进行鉴定;对野生型菌株BC22、突变体BCG183和回复突变体BCG183/B...

试验考察了酶解植物蛋白对建鲤生长性能、肝胰脏和肠道发育及消化酶活性的影响。体质量为(9.18±0.21)g的建鲤900尾,随机分成6个处理组,每组3个重复,每个重复50尾,分别饲喂酶解植物蛋白替代相应完整植物蛋白0、20%、40%、60%、80%和100%的试验饵料,试验期为60d。结果表明,酶解蛋白替代完整蛋白40%时,生长速度最快,饵料系数最低,摄饵量、蛋白和灰分沉积率最高;替代比例在60%以下时,肠重和肠皱襞高度、肠道脂肪酶、碱性磷酸酶、Na+,K+-ATP酶的活性随着替代比例的上升而显著增加;替代比例超过60%以后,生长速度显著降低、饵料系数升高,肠道酶活、皱襞高度、蛋白沉积率下降,而...

【目的】应用RNA干扰技术同时抑制大豆脂肪氧化酶(Lox)和胰蛋白酶抑制剂(KTi)基因的表达,改良大豆品质,培育缺失Lox和KTi的大豆新材料。【方法】应用RNAi原理,以双价RNAi植物表达载体pCAM-BIA1301-KtiRi-LoxRi为基础,以植物表达载体pCAMBIA3301的质粒DNA为模板,利用CaMV35S启动子的上游引物和CaMV35S终止子的下游引物,PCR扩增含有除草剂抗性基因bar的整个表达原件,然后将其插入到pCAM-BIA1301-KtiRi-LoxRi中,构建以除草剂为筛选标记的双价RNAi表达载体,并通过花粉管通道法转化至大豆吉农18、吉农28和吉农27 3...

根据禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)测序菌株NRRL31084(PH-1)的微管相关蛋白基因(map)核苷酸序列设计4对引物,采用PCR方法测定了禾谷镰孢菌对多菌灵(MBC)不同敏感性表型的6个中国菌株的map全序列。DNA序列比对表明,中国的3个敏感菌株和3个抗药菌株的map核苷酸序列相似性没有差异,表明多菌灵抗药性与微管相关蛋白无关。该基因全长1 793 bp,含有6个内含子,编码199个氨基酸;与NRRL31084的map核苷酸序列相似性为99.39%,存在10个差异核苷酸,与其所编码的氨基酸序列相似性为100%。

检测紫外光(ultra violet,UV)照射后棉铃虫HMG-CoA还原酶基因、卵黄原蛋白基因的表达量及棉铃虫产卵量的变化。提取经UV照射后棉铃虫雌虫的总RNA并反转录为cDNA。利用荧光定量PCR(qPCR)技术检测HMG-CoA还原酶基因及卵黄原蛋白基因的表达量。UV照射后,统计棉铃虫雌虫的产卵量。结果表明:UV照射0.5~5.0 h,棉铃虫HMG-CoA还原酶基因的表达量显著增加;UV照射1.0~5.0 h,24 h后取样发现棉铃虫卵黄原蛋白基因的表达量显著增加;UV照射1.0~4.0 h,棉铃虫雌虫的产卵量显著增加。研究结果证实UV照射能影响棉铃虫hmgr、vg的表达量和雌虫的产卵量...