【目的】利用蛋白质连接技术合成氟罗沙星(FLE)人工抗原,制备FLE高亲和力抗体,通过建立、优化FLE的icELISA检测方法研制出快速、灵敏的FLE残留检测间接竞争ELISA试剂盒。【方法】用DCC法偶联FLE和载体蛋白BSA合成免疫原FLE-BSA,用混合酸酐法偶联FLE和载体蛋白OVA合成包被原FIE-OVA,通过紫外扫描法(UV Scan)和聚丙烯凝胶电泳法(SDS-PAGE)鉴定人工合成抗原。选择经初步鉴定成功合成的FLE-BSA免疫SPF级6—7周龄Balb/c雌性小鼠5只,采用多点免疫法,对小鼠背部皮下4-6点注射免疫,免疫剂量为30μg/只,初免,用FLE-BSA PBS溶液与...

在制备多克隆抗体的基础上,研制用于检测莠去津残留的间接竞争ELISA试剂盒。结果表明:莠去津抑制率回归曲线为y=19.762x+5.6026,相关系数R2=0.981,线性检测范围为1~5000μg·L-1,最低检测限为5.35μg·L-1,IC50为176.44μg·L-1。莠去津多克隆抗体的交叉反应率小于20%,莠去津试剂盒的添加回收率均高于75%,供试样品检测结果的批内和批间变异系数均低于10%。试剂盒在4℃或-20℃下贮存270d仍有效。

在建立磺胺甲噁唑单克隆抗体(SMZmAb)杂交瘤细胞株和阻断ELISA方法的基础上,研制出SMZ残留快速检测试剂盒(SMZ-Kit),并对其性能进行了测定。结果表明,SMZ-Kit的标准曲线呈典型的S型,符合4参数logit曲线拟合,相关系数R2=0.990 1,检测范围为1.0~128.0μg/L,灵敏度为0.73μg/L,半数抑制浓度(IC50)为11.5μg/L,检测限为1.0μg/L;饲料样、牛奶样的平均添加回收率为83.9%,83.3%,平均批内和批间变异系数均<15%;SMZ-Kit与磺胺嘧啶的交叉反应(CR%)为2.88%,与其他磺胺类药物无交叉反应;试剂盒在4℃可保存6个月。

【目的】建立诺氟沙星(norfloxacin,Nor)免疫检测试剂盒。【方法】基于所制备的诺氟沙星单克隆抗体,通过矩阵法筛选最佳抗体工作浓度和二抗工作浓度,建立诺氟沙星间接竞争ELISA试剂盒(Nor-kit),并对其性能进行了鉴定和确证。【结果】Nor-kit的平均IC50为5.18μg.L-1,灵敏度为0.31μg.L-1,检测限为1.00μg.L-1。试剂盒除了和诺氟沙星反应外,还和同系物中的培氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、洛美沙星及恶喹酸有不同程度的交叉反应。奶样中回收率平均为103.23%,变异系数(CV)为9.33%。3个不同批次试剂盒的测定结果中,批内变异系数小于10%,且批间变异...

本研究旨在研制一种以紧密素为检测靶标的间接ＥＬＩＳＡ技术，检测血清中产志贺毒素大肠杆菌（ＳｈＩｇＡ ｔｏｘＩｇＥｎＩｃ ＥＳｃｈＥｒＩｃｈＩＡ ｃｏＬＩ，ＳｔＥｃ）的抗体水平。根据紧密素２７个亚型的ｎ端保守序列，体外表达３９０～５４３ ＡＡ片段制备包被抗原，通过敏感性、特异性、重复性和稳定性实验，建立检测ＳｔＥｃ的抗体的间接ＥＩＩＳＡ方法。经优化筛选的间接ＥＬＩＳＡ最佳反应条件：抗原包被浓度３ ｎｇ／孔，待检血清稀释比例１∶２００，ｈｒＰ－兔抗羊Ｉｇ ｇ、ｈｒＰ－兔抗牛Ｉｇ ｇ的工作浓度均为１∶１５０００，５％脱脂奶封闭Ｌ ｈ，底物作用时间１０ｍＩｎ，用于牛、羊疫苗抗体检测或者ＳｔＥｃ大肠杆菌．．．

采用制备的兔抗血清建立了甲胺磷 (methamidophos,MTP)残留的间接竞争性ELISA方法 ,证明了抗血清的特异性较好 ,并确立了测定参数 :抗血清与包被抗原的最佳工作浓度分别为 1∶30 0 0和 1∶5 0 0 0 ;最适检测范围为 0 .0 1～ 0 .1μg/ml;批内变异系数 7.5 6 % ,批间变异系数 5 .70 %。

[目的]建立β_2-受体激动剂类药物多残留间接竞争ELISA检测方法,为动物食源性β_2-受体激动剂类药物残留的快速检测提供技术支持。[方法]以沙丁胺醇多克隆抗体为基础,优化间接竞争ELISA的检测条件,建立一种快速检测猪尿中沙丁胺醇、卡布特罗、西布特罗、克伦特罗、溴布特罗、马布特罗、克伦潘特、可尔特罗、吡布特罗、马喷特罗、比托特罗与妥布特罗等12种β_2-受体激动剂类药物的间接竞争ELISA检测方法。[结果]建立的β_2-受体激动剂类药物间接竞争ELISA检测方法的最佳反应条件为:37℃,抗原以1:10 000倍包被1 h,抗体以1:40 000稀释作用40 min,酶标抗体以1:20 000稀释作用40 min。采用建立的间接竞争ELISA最佳反应条件对猪尿中的β_2-受体激动剂类药物残留进行检测,结果表明12种β_2-受体激动剂类药物在0.1～20μg/L范围内线性关系良好,相关系数均大于0.952;检出限为0.15μg/L,定量限为0.5μg/L;在0.5与1.0μg/L的添加浓度下,回收率为68.4%～114.2%,批内、批间RSD分别为0.4%～10.1%和0.4%～12.5%。[结论]所建立的β_2-受体激动剂类药物残留ELISA检测方法操作简单、快速,灵敏度高,适用于猪尿中β_2-受体激动剂药物的筛选与检测。

【背景】副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）是猪的上呼吸道病原菌，引起格拉瑟氏病，主要引起断奶前后和保育阶段的猪发病，通常见于5—8周龄的青年猪，发病率一般为10%—15%。该菌有15种血清型，目前主要养猪国家流行的血清型为4型、5型、12型和13型，是严重危害养猪业发展的主要细菌性病原之一。目前国内还没有检测该菌抗体的商品化试剂盒。【目的】研制一种针对副猪嗜血杆菌的快速、敏感和特异性强的抗体检测试剂盒，为格拉瑟氏病的有效防控提供技术支持。【方法】表达并纯化OppA、DppA、HbpA 3种不同的副猪嗜血杆菌ABC转运体周质底物结合蛋白，使用副猪嗜血杆菌阴、阳性参考血清筛选以上3种蛋白中免疫反应性和反应特异性好的蛋白。以筛选的蛋白为包被抗原，建立检测HPS抗体的间接ELISA方法，优化间接ELISA反应条件，并组装试剂盒。在此基础上，确定该试剂盒的敏感性、特异性；通过对不同时间、不同猪场采集的2 000份临床猪血清样本进行检测，评价该试剂盒的实用性；在以上临床血清样本中随机选取200份，分别以研制的试剂盒、间接血凝试验以及进口商品化试剂盒进行检测，比较检测结果，验证该试剂盒的符合率；最后，使用研制的试剂盒检测免疫和攻毒猪采集的血清，评价该菌免疫后的抗体消长规律。【结果】成功表达并纯化了OppA、DppA、HbpA 3种蛋白，发现OppA免疫反应性和反应特异性最好。经过反应条件优化，确定OppA包被浓度为1μg·mL-1，封闭液为0.5%的BSA-PBS溶液，样品稀释液为1%的BSA-PBST溶液，样品孵育时间为30min，样品稀释度为1:50，酶标二抗孵育时间为3 0min，底物作用时间为15 min，临界值为0.18；试剂盒的敏感性和特异性为96.67%，能与国内常见血清型HPS阳性血清反应而不与猪其他常见病原阳性血清发生交叉反应；2 000份临床血清样本阳性检出率为34.65%；随机抽取200份血清样本，与间接血凝试验的符合率为92.50%，与进口商品化试剂盒符合率为87.00%，符合率较高；使用试剂盒检测免疫和攻毒后不同时间采集的猪血清，HPS抗体消长规律符合预期。【结论】研制的副猪嗜血杆菌ELISA抗体检测试剂盒特异性高、敏感性强，与商品化试剂盒和间接血凝试验的符合率高，可用于临床HPS抗体检测和疫苗免疫效果评价。

【目的】研制一种检测胞内劳森菌（Lawsonia intracellularis,LI）抗体的间接ELISA试剂盒，为LI的监测和疫苗评价提供工具。【方法】表达并纯化LI的外膜蛋白Omp2，以其为包被抗原建立检测LI抗体的间接ELISA方法，优化ELISA反应条件；用建立的ELISA方法检测稀释的LI阳性血清来评价试剂盒的敏感性，检测其他病原的阳性血清来评价试剂盒的特异性；试制3批试剂盒，制定试剂盒的敏感性和特异性检验标准，测定试剂盒在4℃的保存期；用试制的试剂盒检测LI阴性和阳性质控血清，研究试剂盒的成立条件；通过对不同时间和猪场采集的1 000份临床猪血清样本的检测来评价该试剂盒的实用性；用本试剂盒与进口商品化试剂盒平行检测LI阳性和阴性血清各50份以评价试剂盒的符合率。【结果】成功表达并纯化了Omp2蛋白，蛋白纯度为90.31%，在Western blot试验中可以与LI阳性血清发生反应。ELISA最佳反应条件为：Omp2以200 ng/孔4℃包被12-16 h；血清1﹕50稀释，37℃孵育30 min；羊抗猪Ig G-HRP 1﹕20 000稀释，37℃孵育30 min;TMB底物37℃显色15 min，用0.5 mol·L^-1的硫酸终止反应。该试剂盒检测LI阳性血清的最高检出倍数为8，敏感性较好；试剂盒检测E.coli、App、Mhp、SS2、PRRSV、PRV的结果均为阴性，特异性较好。制定了试剂盒的敏感性和特异性检验标准。试剂盒在4℃可保存15个月。试剂盒的成立条件为：阳性标准血清OD_450nm≥1.25，阴性标准血清OD_450nm<0.3。试制的试剂盒批内、批间重复性试验变异系数均小于10%。与国外商品化ELISA检测试剂盒对比的符合率达86%。用试制的ELISA试剂盒检测1 000份华东部分地区临床猪血清样品，其中LI阳性检出率为59.90%，表明LI在华东地区猪群中普遍存在。【结论】本研究开发的LI间接ELISA抗体检测试剂盒特异性高，灵敏度高，与商品试剂盒符合率高，可用于临床LI抗体的检测。

制备牛血清白蛋白-链霉素(SM-BSA)免疫Balb／c小鼠,用细胞融合技术制备抗链霉索单克隆抗体(SM mAb)杂交瘤细胞,体内诱生腹水法制备SM mAb。依据竞争ELISA原理,应用SM mAb研制SM快速ELISA检测试剂盒(SM-Kit),并对其灵敏度、准确度、特异性、基质效应性等进行检测。结果表明,SM-Kit标准曲线呈典型的S型,线性检测范围为1～128μg／L,相关系数R2=0．925 1,灵敏度为0．45μg／L,半数抑制浓度(IC50)为7．76μg／L,检测限为1μg／L;奶样、猪尿样的平均添加回收率分别为104．45％和84．1％;SM-Kit与双氢链霉素的交叉反应率(C...

【目的】研制一种能有效指示假阴性的PCR检测产品,用于沙门氏菌快速、准确、灵敏的检测。【方法】针对沙门氏菌invA基因、stn基因序列分别设计引物与扩增内标,建立添加扩增内标的沙门氏菌PCR检测方法,组装试剂盒,并对试剂盒的各项性能进行评价。【结果】试剂盒对147株沙门氏菌和28株非沙门氏菌的检测结果显示,所有沙门氏菌均能扩增出362 bp的目标条带,非沙门氏菌仅扩增出520 bp的内标条带。试剂盒检测沙门氏菌基因组DNA的检测限为8.0 fg/PCR,检测染菌量为4—5 CFU/10 mL的牛奶样品,增菌8—10 h即得到阳性结果。反复冻融60次或-20℃下贮存1年,均不影响试剂盒的使用效果...

【目的】研制快速、灵敏、特异的恩诺沙星残留检测ciELISA试剂盒(ENR-Kit),为动物源性食品中恩诺沙星(ENR)残留的快速免疫学检测奠定基础。【方法】通过细胞融合技术制备恩诺沙星单克隆抗体(ENR mAb)杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法生产ENR单抗,应用ENR mAb研制ENR残留间接竞争ELISA(ciELISA)快速检测试剂盒,并对其灵敏度、半数抑制浓度(IC50)、特异性、准确度和基质效应性进行检测。【结果】筛选出2株杂交瘤细胞,其单抗亚类均为IgG1亚型。4G1-B3杂交瘤细胞株的ENR mAb间接ELISA效价为1∶1.024×106,亲和常数(Ka)为9×1010L/moL...

将施氏鲟(Acipenser scherenscki,体重75-95 g)暂养于室内玻璃水族箱内7 d后进行实验。所用达氟沙星(Danofloxacin)纯度为99。5％。分别以剂量800、1040、1352、1157.60、2284.88和2970.34 mg／(kg体重)对施氏鲟进行口灌,以400、440、484、532.4、585.6和644.2 mg／(kg体重)进行腹腔注射达氟沙星水溶液,给药后连续10 d观察实验鱼的行为及死亡情况。用改进的寇氏法计算得出施氏鲟腹腔注射达氟沙星的LD50为429.47 mg／(kg体重),LD50的95％可信限为425.22-433.66 mg／(k...

【目的】建立合成多肽抗原检测FMD NSP抗体的ELISA方法。【方法】固相法合成特异性FMDV NSP B细胞表位肽,将其偶联在BSA载体蛋白上,作为抗原包被在ELISA板上,制备检测抗FMDV NSP抗体的ELISA试剂盒,并对该试剂盒进行方法考核。【结果】抗原包被浓度选择2.5μg·mL-1;检测199份血清标本,与美国UBI商品试剂盒符合率达到96.48%,与国产3ABC ELISA比较,符合率为97.48%,显示极好的一致性。【结论】该合成肽ELISA试剂盒可以用以检测NSP抗体,从而鉴别FMD的自然感染与疫苗免疫,试剂盒特异性强,重复性好、稳定性高,操作简便。

本研究旨在用ELISA试剂盒建立一种简便、可靠的猪肝脏中克仑特罗残留的检测方法。添加了适量克仑特罗标准工作液的肝脏样品同 5倍 0 .1mol/L的盐酸溶液匀浆 ,冻藏、解冻后离心。上清液用正已烷萃取脂溶性杂质 ,再用氢氧化钠溶液调节pH至 1 2。用异丁醇提取待测药物 ,将提取液在 6 0℃用氮气吹干。用 1mL试剂盒中的稀释液将残渣溶解后 ,用ELISA法在 4 50nm处检测克仑特罗的含量。该方法的线性范围为 0 .1 3～ 5.3ng/mL ,回归方程为y=- 1 .80 0x + 2 .2 85,相关系数r=0 .997,最低检测限为 0 .1 3ng/mL ,最低可定量限为 0 ....