[目的]为研究肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)基因表达对竹子木质素生物合成的影响,对毛竹(Phyllostachys edulis (Carrière) J. Houz.)中PeCCR基因的表达情况进行分析,并对PeCCR基因功能进行研究,以期为利用CCR基因在竹子中开展基因工程育种提供参考依据。[方法]采用实时定量PCR(qRT-PCR)方法对PeCCR基因在毛竹不同组织以及不同高度笋中的表达进行了分析,采用RT-PCR方法克隆了PeCCR基因的编码区,构建了基因过量表达载体,采用蘸花法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana L.),采用溴乙酰法测定转基因植株茎木质素的含量。[结果]qRT-PCR结果表明:在毛竹实生苗根中PeCCR的表达量最高,其次是笋中,而未展开叶中最低;在野外随着笋高度的增加,木质化程度加强,PeCCR基因的表达量呈上升趋势,在6.7 m笋中达到最高。克隆获得PeCCR编码区长度为1 026 bp,编码一个341 aa的蛋白,具有家族蛋白特有的保守结构域"NWYCYGK"。与野生型拟南芥相比,转PeCCR基因植株叶片明显增大,且抽苔时间提前3～4 d。茎横切的组织化学染色观察发现:转基因植株茎的木质部和束间纤维组织染色面积均大于野生型;木质素含量测定表明,2个过表达PeCCR1转基因株系中的木质素含量均明显高于野生型,分别为野生型对照的123.1%和116.7%。[结论]PeCCR基因在毛竹不同组织的表达存在差异,在笋中随高度增加其表达量上调。过量表达PeCCR促进了转基因拟南芥植株的生长发育,提高了木质素含量。

［目的］肉桂酰辅酶Ａ还原酶（ＣＣＲ）是木质素合成的关键酶。本文旨在通过克隆和鉴定石榴ＣＣＲ基因（Ｐｇ ＣＣＲ）来探究石榴木质素的合成机制以及培育软籽石榴新品种。［方法］以石榴品种‘红玉石籽’（ＰｕｎｉＣＡ ｇＲＡｎＡｔｕｍ‘ＨｏｎｇｙｕｓＨｉｚｉ’）籽粒为材料，利用ＲＡＣＥ和Ｒｔ－ＰＣＲ的方法，获得Ｐｇ ＣＣＲ基因的全长序列。通过实时荧光定量ＰＣＲ分析Ｐｇ ＣＣＲ基因在不同品种、不同组织、籽粒不同发育时期的表达水平。［结果］Ｐｇ ＣＣＲ基因Ｃ ＤｎＡ全长序列１ ０１７ ｂＰ，编码３３８个氨基酸，包含被认为是ＣＣＲ蛋白催化位点的保守序列ＫｎＷｙＣｙｇＫ。系统进化树分析表明，Ｐｇ ＣＣＲ与其他物种．．．

［目的］肉桂酰辅酶Ａ还原酶ＣＣＲ（ＣｉｎｎＡｍｏｙｌ－Ｃｏ Ａ ＲｅｄｕＣｔＡｓｅ）在植物木质素代谢中起重要的作用，能够将羟基肉桂酸还原生成肉桂醛。本文目的是研究不同芹菜中肉桂酰辅酶Ａ还原酶基因ＡｇＣＣＲ在芹菜中组织表达和非生物胁迫过程中的响应情况。［方法］以２个芹菜品种‘六合黄心芹’和‘文图拉’为材料，分别克隆出编码肉桂酰辅酶Ａ还原酶的基因ＡｇＣＣＲ。利用荧光定量ＰＣＲ分析不同芹菜组织和２种芹菜在高温、低温、干旱和盐胁迫下ＡｇＣＣＲ的表达情况。［结果］序列分析表明，‘六合黄心芹’和‘文图拉’中ＡｇＣＣＲ基因均含有１个长度为１ ０１４ ｂＰ的开放阅读框，编码３３７个氨基酸，二者的核苷酸位点有３．．．

肉桂酰-辅酶A还原酶(Cinnamoyl Co-A Reductase,CCR)是木质素合成中的关键酶,根据植物中CCR保守序列设计引物,以尾叶桉GLU4嫩茎为材料克隆到其CCR基因,命名为Eu CCR。该基因g DNA长2 918bp,c DNA长1 045 bp,CDS区编码336个氨基酸。EuCCR核酸序列与Gen Bank已登录的桉属植物CCR基因同源性达到96%以上,与伞房属、杯果木属植物CCR的同源性达85%以上,其编码的氨基酸序列经比对发现具有完整FR_SDR_e结构域及NADP结合位点和底物结合位点,与可可树等植物中CCR基因编码序列同源性也在84%以上,确定为CCR基因。对E...

对马尾松肉桂酰辅酶A还原酶基因(CCR)进行扩增、克隆和测序(GenBank登录号:EU753854)。应用MEGA4.0.2软件对不同树种CCR基因的核苷酸和氨基酸序列进行比对,结果表明:马尾松CCR基因的外显子和内含子数目与火炬松、杨树、银合欢、光皮桦、冈尼桉、柳桉、蓝桉的外显子和内含子数目相同,都有5个外显子和4个内含子。马尾松CCR基因编码区975bp,编码324个氨基酸。马尾松外显子Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,V分别为133,155,186,353,148bp,而内含子Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ分别为1450,216,737,941bp。马尾松CCR外显子和内含子连接处序列除内含子Ⅱ/外显子Ⅲ出现GTPuG...

【目的】分别克隆甘蓝型油菜(Brassica napus L.)和白菜型油菜(Brassica rapa L.)肉桂酰辅酶A还原酶1(cinnamoyl-CoA reductase 1,CCR1)基因,并进行生物信息学和表达模式分析。【方法】基于甘蓝型油菜和白菜型油菜转录组测序信息,分别从contig文库中获得了一个CCR1基因mRNA转录本片段,利用RACE技术分别获得一个CCR1基因的cDNA全长,对其进行生物学分析,并用实时定量PCR方法分析CCR1基因在甘蓝型和白菜型油菜开花期根、茎、叶、花中的表

[目的]本文旨在分析旋毛虫反式-2-烯酰辅酶A还原酶1(TER1)对大鼠免疫系统功能的影响。[方法]通过RT-PCR方法克隆旋毛虫TER1基因,构建表达载体,获得重组蛋白(rTER1)并检测其酶活性,用Western blot分析rTER1的反应原性。将大鼠外周血单个核细胞(PBMC)与rTER1共孵育,用免疫荧光试验(IFA)检验rTER1与大鼠PBMC的结合情况,分析rTER1对细胞增殖、迁移、NO分泌、吞噬功能和细胞凋亡的影响。大鼠腹腔注射rTER1后,测定血清中IFN-γ、IL-4、IL-9、IL-17和TGF-β等细胞因子的变化。[结果]体外试验表明,rTER1能够促进大鼠PBMC的增殖与迁移,增强细胞NO分泌和吞噬功能,提高细胞凋亡比例;体内试验显示,rTER1能促进大鼠IFN-γ分泌,抑制IL-17分泌,但对IL-4、IL-9和TGF-β的分泌无显著影响。[结论]旋毛虫反式-2-烯酰辅酶A还原酶1能通过多种途径影响宿主免疫功能。

白蜡虫脂酰辅酶A还原酶(FAR1)参与了体表蜡泌物的形成过程,为了进一步研究FAR1的功能,通过预测分析基因far1编码的蛋白结构,选取亲水性强、特异性好的一段合成多肽作为抗原肽,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并以BCA蛋白浓度试剂盒测定抗体浓度,通过SDS-PAGE考马斯亮蓝染色观察纯化抗体的纯度,以ELISA检测抗体效价。结果表明,纯化所得的多克隆抗体纯度高,抗体浓度0.7 mg·mL-1,抗体效价为1:512 000,为后续FAR基因功能的研究奠定基础。

为探究脂酰辅酶A脱氢酶对脂肪酸β氧化的调控机制,使用RT-PCR在鲤鱼肝脏克隆了脂酰辅酶A脱氢酶家族中的MCAD和LCAD全长c DNA序列,阅读框分别为1 275,1 326 bp,编码424,441个氨基酸,分析表明他们均具备ACADs家族的特征序列:FAD结合位点、底物结合位点、催化位点等,与斑马鱼MCAD和LCAD的一致性分别为93.16%和94.56%。实时定量RT-PCR结果表明,MCAD和LCAD主要在肝脏和心脏表达;不同脂肪源对MCAD的表达没有明显影响,但鱼油对LCAD的表达有明显的刺激

【目的】γ-谷氨酰磷酸还原酶是真菌脯氨酸合成途径中的一个关键性酶,本研究旨在对核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)γ-谷氨酰磷酸还原酶编码基因SsGPR1进行沉默,并对沉默转化子菌丝生长、菌核形成和致病力等表型进行研究,为揭示核盘菌的生长发育与致病机理打下基础,并为作物菌核病的绿色防控提供线索。【方法】通过BLAST进行蛋白同源比对分析,并利用MEGA 5.0软件构建蛋白进化树。通过实时荧光RT-PCR检测SsGPR1在核盘菌菌丝生长、菌核发育和萌发的各个阶段以及致病不同时期的表达模式。根据RNA干扰原理构建SsGPR1的沉默载体,通过PEG介导原生质体转化的方法将沉默载体转入到野生型核盘菌菌株1980中。利用实时荧光RT-PCR鉴定基因沉默转化子,对沉默转化子的菌丝形态、生长速度和菌核形成等表型进行观察,并测定沉默转化子在氧化胁迫条件下的菌丝生长。将沉默转化子分别接种至活体油菜叶片和拟南芥植株,观察并测量病斑大小。通过酸性茚三酮法对沉默转化子中的游离脯氨酸进行测定。【结果】核盘菌SsGPR1全长1 454 bp,编码449个氨基酸,在氨基酸H~(10)-N~(426)处含有谷氨酰磷酸还原酶结构域。同源比对发现SsGPR1蛋白与灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的BC1G_13183蛋白和白霉病菌(Sclerotinia borealis)的SBOR_2215蛋白相似性最高,氨基酸序列一致性分别达95%和94%,系统进化树结果表明三者聚为一个小的分支。SsGPR1在核盘菌菌丝生长时期的表达量较高,在菌核不同发育阶段表达量相近,但均低于菌丝生长时期。SsGPR1在致病时期表达量不断升高,在接种后9 h表达量最高。将SsGPR1基因沉默载体pSIGPR1导入到核盘菌野生型菌株中,并通过实时荧光RT-PCR检测不同转化子中SsGPR1的表达水平,结果表明SiGPR1-104和SiGPR1-149为SsGPR1基因沉默转化子。沉默转化子在PDA培养基上形成的菌核数量及均重与野生型菌株无显著性差异,且菌核均能萌发形成子囊盘,但菌丝生长稠密,生长速度显著下降。在含有H_2O_2的培养基中,SsGPR1基因沉默转化子菌丝生长受到更强的抑制,表明沉默转化子对氧化胁迫更加敏感。SsGPR1基因沉默转化子在活体油菜叶片和拟南芥植株上能引起发病,但病斑面积减小,表明沉默转化子致病力减弱。SsGPR1基因沉默转化子菌丝中的游离脯氨酸含量与野生型菌株相比无显著差异。【结论】SsGPR1与核盘菌的生长和菌丝形态相关,且参与核盘菌对氧化胁迫的抵御及致病过程。

中链酰基辅酶Ａ合成酶（ＭＡＣＳ）属于腺苷酸合成酶超基因家族，催化中链脂肪酸与辅酶Ａ结合形成相应的中链酰基辅酶Ａ。本研究通过同源检索毛果杨基因组数据库中的４ＣＬ基因，克隆得到毛果杨Ｐｔ ＭＡＣＳ１的基因序列（基因编号：ｅＳｔ ｅｘｔ＿ｆｇｅｎｅＳｈ４＿Ｐｇ．Ｃ＿６４００６６）。通过序列分析可知，Ｂｏｘ Ｉ和Ｂｏｘ ＩＩ两个在４ＣＬ中保守的结构域在该蛋白中并不保守。将Ｐｔ ＭＡＣＳ１与原核表达载体Ｐ ｅｔ－３０Ａ（＋）构建融合表达载体Ｐｔ ＭＡＣＳ１－Ｐ ｅｔ－３０Ａ（＋），转化大肠杆菌ＢＬ２１（Ｄｅ３）后诱导重组蛋白进行表达。镍柱纯化重组蛋白后进行酶学活性分析，研究结果表明该蛋白对中链脂肪酸己酸．．．

4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)催化维管植物木质素生物合成羟基肉桂酸及其衍生物辅酶A酯化合物的形成.该文对我国乡土树种毛白杨重组Pt4CL1的酶学性质进行了初步研究,结果表明:Pt4CL1在高温下不稳定,10%甘油可部分提高其温度稳定性;Pt4CL1酶学反应最适温度为40℃;Pt4CL1在pH 3.0~8.0范围内比较稳定,当pH大于8.0时其Pt4CL1的稳定性下降;最适反应pH为8.0;Mg2+是Pt4CL1最适激活剂,EDTA可抑制其活性;Tris-HCl的最适浓度为0.2 mol/L;4-香豆酸是Pt4CL1的最适底物.

【目的】根据国际桃基因组序列信息,进行克隆和表达分析与桃果实内酯类合成相关的果肉组织酰基辅酶A氧化酶(Acyl-CoA oxidase,ACX)的5个候选基因,为进一步开展桃香气物质代谢分子机理的研究提供新的研究方向。【方法】根据Phytozome(www.phytozome.org/peach)发布的桃ACX全基因组序列设计特异引物对5个基因全长进行克隆测序,与参考编码序列进行比对和编码蛋白性质进行分析,并对这些成员进行组织特异性表达分析。【结果】获得了桃果肉组织中表达的5个ACX编码基因全长序列,PpACX1、PpACX3的CDS区没有突变,PpACX2核苷酸序列871位处A突变为G,导致...

柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)是世界范围内危害淡水鱼类的柱形病的病原。目前对该病原菌遗传操作系统的研究进展较慢,而寻找高效稳定的启动子来调控外源基因在细菌体内的表达,有可能促进该细菌遗传操作系统的构建。本研究获得了柱状黄杆菌乙酰辅酶A合成酶基因(acetyl-coenzyme A synthetase gene,acs)的编码序列及其上游调控序列,该基因全长2 323 bp,编码635个氨基酸。通过序列分析,发现在该基因起始密码子ATG的上游存在核糖体结合位点(ribosome biding site,RBS)序列TAAAA,和启动子–7和–33的保守基序TAT...

木质素是绿色植物生长发育所需的重要化合物之一。肉桂酰辅酶Ａ还原酶（ＣＣＲ）是在木质素合成过程中，催化苯丙烷类合成途径第１步的关键酶。本文以其底物之一——对香豆酰辅酶Ａ酯为例，以现有的辅酶Ａ酯合成纯化的文献报道为参考，介绍经过整合改进并不断试验而得到的ＣＣＲ底物的合成与纯化方法。从大肠杆菌中提取出来的重组酶４－香豆酸辅酶Ａ连接酶（４ＣＬ）用于合成ＣＣＲ底物，这比从植物组织中提取更易获得。提纯后的４ＣＬ可以在－８０℃下保存３、４个月。４ＣＬ反应后的产物在２个不同梯度下通过Ｃ１８反相柱进一步纯化，并用高效液相色谱仪监测。在整个纯化过程中，所有用于装载对香豆酸和对香豆酰辅酶Ａ酯的容器都用锡箔纸完全包裹．．．