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[期刊] 中国农业科学
[作者]
李慧峰 冉昆 程来亮 王海波 何平 常源升 李林光
【目的】克隆苹果（Ｍａｌｕｓ×ｄｏＭｅｓｔｉｃａ Ｂｏｒｋｈ．）多个代谢途径中的关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒＢｏｘｙｋｉｎａｓｅ，ｐｅｐｃｋ）基因Ｍｄｐｃｋｓ，研究其在不同组织器官及不同胁迫处理条件下的表达特性，为解析该基因在多个代谢途径中的功能奠定基础。【方法】利用同源比对和ｒｔ－ｐｃｒ技术，克隆获得Ｍｄｐｃｋ１和Ｍｄｐｃｋ２全长ｃｄｎａ序列并进行生物信息学分析；克隆Ｍｄｐｃｋｓ的启动子序列，利用ｐｌａｎｔｃａｒｅ软件在线分析启动子上的顺式作用元件；采用实时荧光定量ｐｃｒ（ｑ ｒｔ－ｐｃｒ）检测Ｍｄｐｃｋｓ在不同组织中的表达以及在水杨酸（ｓａ．．．
[期刊] 浙江农林大学学报
[作者]
屈亚平 张智俊 王超莉 王蕾 吴林军
毛竹Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｅｄｕｌｉｓ阿拉伯糖－５－磷酸异构酶（Ｐｅ Ｋｄｓ ｄ）是２－酮－３－脱氧辛糖酸（Ｋｄｏ）生物合成途径的第１个关键酶。采用逆转录实时聚合酶链式反应（ｑ Ｒｔ－ＰｃＲ）克隆得到毛竹Ｋｄｓ ｄ基因。该基因ｃ ｄＮａ全长１ ０３８ ｂＰ，编码３４６个氨基酸；对不同物种来源的Ｋｄｓ ｄ氨基酸序列进行比对和系统进化树分析。结果表明：毛竹的Ｋｄｓ ｄ与玉米Ｚｅａ ｍａｙｓ等植物来源的Ｋｄｓ ｄ有很高的序列一致性，而与微生物来源的Ｋｄｓ ｄ序列一致性较低。毛竹不同组织实时荧光定量聚合酶链式反应（ｑ Ｒｔ－ＰｃＲ）结果表明：Ｐｅ Ｋｄｓ ｄ基因在叶中表达量远远高于其他组织。在大．．．
[期刊] 中国水产科学
[作者]
郭彪 王芳 侯纯强 董双林 孙皓
研究了水温从17℃突变为27℃对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)稚虾己糖激酶(HK)和丙酮酸激酶(PK)活力及热休克蛋白(HSP70)表达的影响。主要结果如下:(1)温度突变后,凡纳滨对虾肝胰脏中己糖激酶活力逐渐增大,温度突变后3h达到最高,是温度突变前的2.54倍(P<0.05)。随后,对虾己糖激酶的活力逐渐下降,72h酶活力基本恢复到温度突变前的水平。(2)温度突变后1h,凡纳滨对虾丙酮酸激酶的活力降到最低,随后逐渐增大;6h达到最高,随后对虾丙酮酸激酶的活力逐渐下降并在72h恢复到温度突变前的水平。(3)温度突变0.5h后,凡纳滨对虾肌肉中HSP70的表达量迅速升高...
[期刊] 华北农学报
[作者]
潘昱名 刘风珍 万勇善
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)是控制植物籽粒中蛋白质/油脂含量比例的关键酶。本研究利用RT-PCR技术,克隆PEPCase基因的片段,并将克隆的PEPCase基因片段反向连接替代植物表达载体PBI121的GUS基因。从花生栽培品种荔蒲大花生基因组中克隆获得编码PEPCase的基因片段(886 bp),其核苷酸序列与已报道的花生(EU391629)、棉花(AY008939)、大豆(D10717)、拟南芥(AY210895)、豌豆(D64037)PEPCase基因对应部分的同源性分别为99.77%,84.37%,81.54%,81.25%,78.71%,说明我们得到PEPCase基因片段...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
谭永安 肖留斌 孙洋 赵静 柏立新
【目的】克隆绿盲蝽超气门蛋白基因(ALUSP),获得原核表达的重组蛋白,为ALUSP的功能研究奠定基础,也为进一步解析绿盲蝽蜕皮及变态发育的机制提供理论依据。【方法】根据已知昆虫的USP基因序列设计简并引物,获得ALUSP的保守序列;再通过设计特异性引物,利用RACE方法,分别克隆ALUSP 5′及3′段序列,然后通过拼接获得ALUSP全长序列;应用生物信息学方法,对ALUSP基因序列特征及其所编码蛋白的特性进行分析,建立系统进化树;将含有ALUSP的T载体经EcoR I及Xho I双酶切,构建ALUSP原核表达载体pEGX6P1-ALUSP,将该表达载体分别在15、25、30和37℃条件下进...
关键词：
绿盲蝽 超气门蛋白 基因克隆 原核表达
[期刊] 华北农学报
[作者]
张艳 庞金环 吴家和 何朝族
利用农杆菌介导的转化方法研究OsPK1过表达对水稻的影响。将CaMV 35S启动子驱动的OsPK1的全长CDS序列导入到日本晴基因组中。选择3个过表达转基因系作为代表进行鉴定和分析。结果显示,过表达植株在株高、分蘖数、穗长和千粒重四方面接近野生型水稻,结实率略下降,但每穗饱满种子数明显增加。通过定量RT-PCR分析,发现有4个代谢酶在过表达植株嫩叶中表达存在着上调或下调。用GC-MS方法检测糖含量,显示OsPK1过表达株系中葡萄糖、果糖、半乳糖和蔗糖的含量与野生型差异不大。总之,对OsPK1过表达株系的鉴定,有助于更好了解OsPK1的功能,并且每穗饱满种子数明显增加具潜在的应用价值。
关键词：
OsPK1 过表达 丙酮酸激酶 水稻
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
王步勇 问荣荣 马玲 周天华 张萌
应用BLAST比对技术,在松材线虫基因组数据中鉴定得到模式线虫pdk–1的同源基因Bxpdk–1。结合RT–PCR技术进行Bxpdk–1基因完整蛋白编码区(CDS)扩增,得到CDS区全长2298bp。Bx PDK–1蛋白含有"STKc_PDK1""PH_PDK1"2个保守结构域,属于磷酸肌醇激酶超家族。序列比对及进化树分析显示,松材线虫Bx PDK–1蛋白与捻转血矛线虫PDK–1蛋白(CDJ88126.1)同源性为50%,进化树聚在同一小分支上,亲缘关系较近。原位杂交试验表明,Bxpdk–1基因主要在线虫的头部神经元及咽部神经处表达。q PCR结果分析显示,Bxpdk–1基因表达响应鱼藤酮药剂胁迫处理。RNAi试验显示,Bxpdk–1在dsRNA处理12 h时,基因表达量显著下降,基因被沉默。
[期刊] 林业科学研究
[作者]
范正琪 李纪元 田敏 李辛雷 陈东亮 卢孟柱
应用RT-PCR和RACE法从麻疯树总RNA中分离出pepc基因全长cDNA,长度为3 142 bp,阅读框2 898 bp,编码965个氨基酸,在GenBank中登录,序列号为EU069413。它的氨基酸序列与蓖麻、陆地棉、橙、大豆、花生、烟草、油菜、拟南芥的氨基酸同源性分别为94.94%、92.46%、90.60%、90.50%、90.50%、88.33%、84.61%、82.44%。该基因编码了pepc基因家族中的pepc1,蛋白属于C3型PEPC。推测了pepc编码蛋白分子量为110.6 kD,并对其稳定性、二级结构、疏水性等特性进行了分析,最后确定了该蛋白的功能位点和结构域。
关键词：
麻疯树 pepc基因 克隆
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
刘倩 唐亮 谈立松 赵玉军
为获得鸡VEGF基因片段,原核表达GST-cVEG基因,并对融合蛋白进行分离纯化,应用RT-PCR从鸡睾丸中扩增出VEGF片段,将PCR产物克隆至pMD 18-T载体。随后,将cVEGF片段亚克隆至带有GST的原核表达载体pGEX-4T-2中,测序鉴定。将重组质粒pGEX4T2-cVEGF转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,IPTG诱导,并进一步通过Ni-NTA Agarose亲合层析纯化,纯化产物以SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,结果表明,成功地构建了原核表达质粒pGEX4T2-cVEGF。GST-cVEGF融合蛋白在大肠杆菌中得到了表达,Ni-NTA Agarose纯化...
关键词：
cVEGF 融合蛋白 原核表达
[期刊] 中国水产科学
[作者]
李树红 陈志光 李冉 李新 李松 陈秀华 蒋然然 李美良 马璐阳
对原核表达的重组建鲤组织蛋白酶L(Cathepsin L,CAT L)蛋白进行尿素洗涤和Ni-NTA亲和层析纯化,该目的蛋白经300 mmol/L咪唑洗脱为单一峰,SDS-PAGE结合TSK-GEL G2000SWxl凝胶过滤高效液相色谱分析表明重组CAT L获得了高度纯化,分子量约28 k D,纯度超过95%。Z-Phe-Arg-MCA底物测活法显示该重组CAT L表现为半胱氨酸蛋白酶活性,能与其内源抑制因子Cystatin以1︰1的摩尔比结合,具有生物学活性。以纯化的重组CAT L蛋白免疫Balb/C小鼠获得抗血清,经ELISA法检测获得的CAT L抗血清效价高于1︰512000;West...
[期刊] 水产学报
[作者]
郑碧琪 刘学良 黄辉洋 巩杰 叶海辉
采用qRT-PCR、RACE等方法,获得了拟穴青蟹丝裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK)基因cDNA全长序列。该基因全长1 558 bp,开放阅读框长度为1 224 bp,编码407个氨基酸残基。同源分析显示,该基因编码的蛋白与昆虫的相似性高达70%,推测MAPKK基因在节肢动物具有较高的保守性。经荧光定量PCR检测,MAPKK基因在拟穴青蟹多个组织中有表达,且在脑神经节和卵巢中表达量较高。在拟穴青蟹卵巢发育过程中,MAPKK基因在卵巢发育期(Ⅲ期)表达量最高,发育期为卵母细胞快速生长期,推测MAPKK具有促进卵母细胞快速生长的作用。
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
王文婷 张晨燕 赵可冉 丁建华 荆恩荣 杨超
【目的】双组分系统VfmH/VfmI与Dickeya属病原菌的致病因子和致病过程有关。研究D fangzhongdai Onc5菌株vfmH和vfmI基因的克隆、原核表达及蛋白纯化，为明确VfmH/VfmI的调控机理提供依据。【方法】采用RT-PCR方法扩增D. fangzhongdai Onc5菌株，获取vfmH和vfmI基因开放阅读框（ORF）。随后将目的基因克隆至原核表达质粒pET-32a，构建重组质粒pET-32a-VfmH和pET-32a-VfmI，经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达后，利用SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白，并利用Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。【结果】D. fangzhongdai Onc5菌株vfmH和vfmI的ORF大小分别为1 401 bp和1 320 bp，分别编码466个和439个氨基酸；同源性分析表明，其氨基酸序列与Dickeya属其他菌种的vfmH和vfmI序列具有很高的相似性；SDS-PAGE和Western blot鉴定分析表明：添加0.5 mmol·L-1 IPTG，可诱导重组质粒pET-32a-VfmH转化株和pET-32a-VfmI转化株表达产生大量携带His-tag的融合重组蛋白；同时，成功纯化出目的蛋白。【结论】本研究首次克隆出D. fangzhongdai中双组分系统基因vfmH和vfmI，并成功纯化出VfmH和VfmI蛋白。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
蓝贤勇 成军 陈宏 张黎颖 陶明亮 伦永志 洪源 郭江
为了更深入研究XTP5蛋白(也称人类次要组织相容性抗原(mHA-8))的生物学功能,以HepG2细胞总RNA为模板、应用RT-PCR技术获得XTP5基因,再利用基因工程技术对其进行克隆和原核重组表达载体构建和诱导表达,成功克隆XTP5基因,并成功构建原核重组表达空载体pET-32a(+)-XTP5;阳性重组质粒转化大肠杆菌E.coliBL21后,在37℃经终浓度1 mmoL/L IPTG诱导5 h后,受体菌大量表达76.88 ku XTP5重组蛋白;West-ern-blot证实宿主菌表达的蛋白特异性好;肝素亲和层析柱纯化表达产物XTP5蛋白效果良好。结果表明,成功克隆了人类XTP5基因,并获...
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