根据GenBank中毛白杨钙离子依赖型脱氧核糖核酸酶(PtCDD)基因序列,以毛白杨形成层区域的cDNA为模板,经PCR扩增出该基因上游637 bp的cDNA片段。将该片段与PET-30b(+)载体连接,构建杨树PtCDD基因片段原核表达载体并进行表达研究,获得大量的PtCDD-(HIS)6融合蛋白。并进一步对该蛋白进行纯化和功能检测。结果表明:PtCDD基因片段能够在大肠杆菌体内表达出具有DNase功能的蛋白,克服了因表达全酶可能强烈降解DNA所带来的不能最终获得表达产物的问题,为今后PtCDD蛋白的抗体制备以及进一步研究奠定了基础。

利用RT-PCR手段克隆得到1个毛白杨CBF基因cDNA,命名为PtCBF5(GenBank注册:DQ354395)。PtCBF5全长837bp,该序列包括起始密码子ATG和42bp的5′末端非编码区,终止密码子TGA和98bp的3′末端非编码区,开放阅读框编码231个氨基酸。RT-PCR半定量研究表明:PtCBF5在叶片组织中的表达量高,茎、根中的表达量低。组培苗在低温、干旱、NaCl、ABA条件下处理诱导24h,在低温和干旱的条件下PtCBF5表达量在诱导30min后开始增加,分别在2h和6h达到峰值,24h后又恢复到初始水平;而高盐和ABA存在的条件下未有显著变化。PtCBF5在植物体适...

真核翻译起始因子5A(eIF5A)在植物生长发育和抗逆过程中发挥着重要作用。以2个月的毛白杨‘BJHR01’幼苗总RNA反转录的cDNA为模板,克隆得到PtoeIF5A2(GenBank登录号:HQ529480)基因全长cDNA序列。该基因包含483 bp开放读码框,编码160个氨基酸,预测蛋白分子质量为18 kDa,等电点为5.76。Real-Time qRT-PCR分析表明:PtoeIF5A2在6个月毛白杨幼苗叶片中的表达量最高,约为其在幼根中表达量的5倍。PtoeIF5A2响应了干旱、ABA(200μmol·L-1)、低温(4℃),尤其是NaCl(300 mmol·L-1)胁迫。在NaC...

利用PCR技术,从毛白杨花序材料中分离出一个MADS盒基因PtSEP3。蛋白序列比较和同源树分析表明,该基因与拟南芥SEP3同源。表达分析显示PtSEP3不仅在成年植株雌蕊和雄蕊中表达,也在幼茎、幼叶和顶芽中表达。在35S启动子驱动下,PtSEP3超表达的毛白杨转基因植株发生了明显的形态变化,表现为叶序不规则,在同一节间常数枚集生;并且叶片基部形态与野生型的心形不同,大部分为楔形。在离体条件下,在芽分化培养基上,PtSEP3转基因株系的根和叶外植体可以诱导发生带有花柱和子房室的子房状结构。试验结果说明PtSEP3参与了毛白杨花器官的发生,并可能在维持茎端分生组织分化出正常形态的叶片中也起着作用...

【目的】YABBY是高等植物中特有的转录因子家族,在侧生器官发育和开花过程中发挥重要作用。本研究对毛白杨PtYABBY基因进行克隆和生物信息学分析,并对雌雄花芽8个关键发育时期和根茎叶等组织中PtYABBY基因表达模式进行探究,以期为阐明PtYABBY基因在毛白杨侧生器官发育过程中的功能奠定前期基础。【方法】以毛白杨为试材,采用同源基因克隆法从毛白杨中分离FILAMENTOUS FLOWER (FIL)/YABBY3 (YAB3)同源基因PtYABBY3、PtYABBY4和PtYABBY11的编码区序列,并开展生物信息学分析。通过qRT-PCR研究这3个基因在雌雄花芽8个发育时期及根、茎、幼叶、成熟叶片中的表达规律。【结果】PtYABBY3、PtYABBY4和PtYABBY11编码区长度分别为633、642、639 bp,分别编码210、213、212个氨基酸。所推测的氨基酸序列包含C_2C_2锌指结构域和YABBY结构域。系统进化分析进一步表明这3个基因属于FIL/YAB3亚家族成员。qRT-PCR结果显示这3个基因在根、茎、叶及8个时期雌雄花芽组织中均有表达,但PtYABBY基因间的表达水平存在明显差异。PtYABBY3表达水平在雌雄花芽发育初期下调,发育后期上调;花原基形成到休眠期内PtYABBY3在雌雄花芽中呈现相反的表达变化趋势。PtYABBY4和PtYABBY11基因在雌雄株成花诱导期表达水平最高,成花诱导到伸长期内呈现下降趋势,在雄花芽休眠期和小孢子发生期基因表达水平无明显变化。营养组织表达量测定结果显示这3个基因在幼叶和成熟叶片中表达水平相对较高,根系中表达量最低。【结论】YABBY基因家族成员PtYABBY3、PtYABBY4和PtYABBY11同属FIL/YAB3亚类,在毛白杨雌雄花芽发育的8个时期中表达水平存在较大差异,且在叶片和花芽中表达量较高,表明其可能与叶片和花芽发育相关。本研究为今后深入研究YABBY家族成员在杨树器官生长发育过程中的作用奠定基础。

从毛白杨(Populus tomentosa)木质化茎中提取总RNA,利用RT-PCR技术进行cDNA扩增,获得1条1 621 bp的片段。测序结果表明:该片段编码536个氨基酸组成的多肽,序列中包含所有已知4-CL蛋白的2个特征序列boxⅠ(SSGTTGLPKGV)和boxⅡ(GEICIRG)。将cDNA克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,并转化大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞BL21(DE3)。IPTG诱导后,经SDS-PAGE和Western-blot分析表明,4-CL基因在大肠杆菌BL21中获得表达,所表达融合蛋白的分子量约为70 ku。酶活性分析表明:该重...

【目的】通过原核表达系统获得热脱硫弧菌（Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｙｅｌｌｏｗｓＴｏｎｉｉ ｈ．）Ｐｉｆ１解旋酶（ＴｙＰｉｆ１），研究ＴｙＰｉｆ１解旋酶的嗜热特性和解旋机理。【方法】将ＴｙＰｉｆ１解旋酶编码区和ｓｕｍｏ促溶标签编码区融合连入ＰｅＴ１５ｂ获得重组表达载体ＰｅＴ１５ｂ－ｓｕｍｏ－ＴｙＰｉｆ１，将该重组载体导入大肠杆菌ｂｌ２１（ｄｅ３）菌株诱导表达，经ｎｉ－ｎＴＡ柱亲和纯化获得融合蛋白，ｓｕｍｏ蛋白酶切除标签，再经ｎｉ－ｎＴＡ柱去除标签蛋白及ｓｕｍｏ蛋白酶，经ｈｅＰＡｒｉｎ柱进一步纯化最终获得ＴｙＰｉｆ１全长蛋白。通过荧光各向异性、圆二色谱（Ｃｄ）和荧光共振能量转移（ｆ．．．

以毛白杨为材料,结合生物信息学和分子生物学技术,利用现有的杨树基因组EST序列库资源,通过同源序列搜索,经过多次拼接合并,获得了理论的杨树油酸去饱和酶基因PtFAD2 cDNA序列;首次利用RT-PCR方法从杨树这个物种中成功克隆得到毛白杨PtFAD2全长编码序列cDNA(GenBank注册号:DQ316788),该cDNA长1276bp,开放阅读框编码388个氨基酸。RT-PCR半定量研究表明:PtFAD2在叶片、茎、根不同组织中的表达量基本一致,并且在4℃低温处理过程中转录表达量没有变化,说明短时间内该基因表达不受低温诱导。

利用基因特异的PCR引物由毛白杨受干旱胁迫后构建的cDNA文库中扩增获得一PtDREB2A cDNA克隆,并进行测序和序列分析,结果表明:PtDREB2A cDNA片段总长为946 bp,基因内部含有完整的开放阅读框架,大小为864 bp,可编码长度为287个氨基酸残基的蛋白质,所推导的蛋白质氨基酸序列在AP2/ERF结构功能域与拟南芥AtDREB2A和水稻OsDREB2A蛋白的同源性分别为80.3%和83.3%。组织特异性Realtime-PCR结果显示,PtDREB2A在杨树根、茎、叶片和顶端分生组织中均有表达,但其表达模式不同:PtDREB2A在叶片表达丰度最高,在树干皮层及根部组织表达...

组合运用分子生物学及生物信息学方法,首次从毛白杨成熟木质部中分离出编码S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因PtSAHHA的cDNA克隆。序列分析表明,毛白杨PtSAHHA cDNA片段全长为1 935 bp,其内部含有大小为1 458 bp的完整开放阅读框架,可编码含有485个氨基酸残基的蛋白质。组织特异性Realtime-PCR结果显示,PtSAHHA在木质部中表达丰度最高,在形成层和老叶中表达丰度中等,在嫩叶中表达丰度最低。在此基础上,组合利用MAGE5.0和DnaSP5软件对毛白杨自然群体中45株基因型个体的PtSAHHA序列进行对比和分析,共检测到166个单核苷酸多态性(SNP)位点,SNP频...

组合利用生物信息学和RT-PCR方法,首次从毛白杨未成熟木质部cDNA中分离出PtCesA4cDNA全长,并进行测序和序列分析,结果表明克隆的毛白杨PtCesA4 cDNA片段总长为3757bp,基因内部含有完整的开放阅读框架,大小为3129bp,可编码长度为1042个氨基酸残基的蛋白质,所推导的蛋白质氨基酸序列与拟南芥AtCesA4、水稻OsCesA1和火炬松PtCesA2的蛋白质氨基酸序列同源性分别为80.3%,78.9%和75.6%。组织特异性Realtime-PCR结果显示,PtCesA4基因在杨树根、茎、叶片和顶端分生组织中均有表达,但其表达模式却不同:PtCesA4在成熟叶片、未成...

利用RT-PCR方法,首次从毛白杨成熟木质部cDNA文库中分离出PtSUS1 cDNA全长,并进行了测序和序列分析。结果表明:克隆的毛白杨PtSUS1 cDNA片段总长为2703bp,基因内部含有完整的开放阅读框架,大小为2415bp,可编码长度为805个氨基酸残基的蛋白质,所推导的蛋白质氨基酸序列与拟南芥AtSUS1、水稻OsSUS1的蛋白质氨基酸序列同源性分别为83.4%,75.7%。组织特异性Realtime-PCR结果显示,PtSUS1在成熟木质部表达丰度最高,在成熟叶片、根部和正在发育的木质部表达丰度中等,在韧皮部和形成层有少量表达,在嫩叶与顶端分生组织中表达丰度最低。在此基础上,组...

【目的】基于飞蝗(Locusta migratoria)转录组数据库获得内表皮蛋白(endocuticle structural glycoprotein)基因Lm Abd-5的c DNA序列,分析该基因的序列特征和m RNA表达特性,采用RNAi方法分析其生物学功能,探讨其在飞蝗表皮形成中的作用,为害虫防治提供新的分子靶标。【方法】采用生物信息学方法搜索飞蝗转录组数据库,获得Lm Abd-5 c DNA全长序列并克隆验证;采用Signal P在线软件分析蛋白的信号肽,利用SMART网站预测其功能域,使用

【目的】次生维管系统再生能够在树干维管系统丧失后通过去分化、再分化或转分化等组织修复手段实现维管组织的再生。为了鉴定和研究次生维管系统发育相关的重要基因和调控元件,本文利用毛白杨次生维管再生系统,分析了不同再生时期的基因表达模式,为进一步揭示木材形成的基因调控机制奠定基础。【方法】将4年生毛白杨无性系在形成层活动旺盛期进行环剥取样。对剥皮后的树皮内侧和树干表面的样本,以及再生第7、10、14、18和21天5个不同时期获取的再生材料进行高通量转录组分析,并利用基因共表达分析(WGCNA)方法,得到与不同再生时期密切相关的模块,并对这些特异表达的基因进行表达网络和生物学功能分析。【结果】将第0天(剥皮当天)树皮内侧样本与树干表面样本、再生第7天样本与树干表面样本,以及相邻再生时期的样本进行表达差异分析。对得到的14 202个差异基因进行WGCNA分析,构建基因共表达网络,获得与维管再生过程相关的10个共表达模块。其中,Grey60模块的基因在再生第7天样本和树皮内侧样本中特异表达,主要涉及DNA复制、有丝分裂、细胞分裂和微管运动等功能;该模块还含有大量与表观遗传调控、细胞周期相关的基因,它们在再生第7天的高表达可能激活了脱分化木质部细胞的增殖和组织类型的改变,使其获得再分化能力。此外,Pink模块的基因在第0天成熟维管组织样本中的表达量极低,但在再生过程中表达呈上升趋势,到第21天达到最高值;这些基因主要参与细胞分裂、细胞壁修饰、韧皮部发育、碳水化合物代谢、DNA的转录调控等相关的生物学途径。Pink模块中与韧皮部分化相关的标记基因,比如APL、NAC45/86、DOF、BSPA、PP2和SUS的表达被重新激活,与调节形成层细胞增殖和分化的CLE41/44和CLV1一样,表达量都是从再生第10天开始逐渐增加。到次生维管系统再生后期的第18天和第21天,形成层已经完成了结构重构并能进行细胞的分裂、分化,此时木质部标记基因和次生壁调控因子有较高的表达。【结论】毛白杨次生维管系统再生早期,脱分化的木质部细胞通过表观遗传和细胞周期调控重新获得细胞分生能力;之后,韧皮部的细胞分化程序被启动,再生形成层开始细胞增殖和分化;到再生后期,通过相关基因调控,形成层再分化木质部和韧皮部。通过对次生维管组织再生过程中基因的表达分析和调控模块的鉴定,进一步验证了次生维管再生的遗传调控基础,也可为揭示植物维管组织再生的调控机制奠定基础。

【目的】NAC类转录因子是植物特有的最大的转录因子家族之一,广泛参与植物的生长发育过程,并在植物响应盐、干旱等多种非生物胁迫的过程中发挥至关重要的调控作用。本研究拟从盐生木本植物刚毛柽柳中克隆获得一个NAC转录因子基因,研究该基因的耐盐、抗旱功能,以期为研究木本植物NAC转录因子的抗逆分子机制奠定理论基础。【方法】在刚毛柽柳NaHCO_3胁迫转录组数据库中筛选获得一个NAC转录因子基因,将其命名为ThNAC24(GenBank登陆号:KF031949)。利用生物信息学工具将其与其他9个物种的NAC蛋白进行多序列比对,与拟南芥105个NAC蛋白进行进化树分析。分别用300 mmol·L~(-1) NaCl和400 mmol·L~(-1)甘露醇对刚毛柽柳进行胁迫,在胁迫6、12、24和48 h后分别取刚毛柽柳根及叶组织。通过实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)技术分析盐、干旱胁迫下ThNAC24基因在不同胁迫时间点及不同组织的表达情况,初步鉴定其是否响应盐、干旱胁迫。为进一步研究ThNAC24基因的抗逆功能,分别构建植物过表达(pROKⅡ-ThNAC24)及抑制表达(pFGC5941-ThNAC24)载体。利用农杆菌介导的高效瞬时遗传转化体系获得ThNAC24基因瞬时过表达(OE)、抑制表达(IE)及对照(Control)刚毛柽柳植株。在盐、干旱胁迫下分析比较了ThNAC24基因瞬时过表达、抑制表达及对照刚毛柽柳植株的二氨基联苯胺(DAB)和氯化硝基四氮唑蓝(NBT)染色情况,过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性,及电解质渗透率、失水率及丙二醛(MDA)含量,鉴定ThNAC24基因的耐盐、抗旱功能。【结果】ThNAC24基因的开放阅读框为1 023 bp,编码340个氨基酸。多序列比对结果显示ThNAC24在N端的氨基酸序列相似度比较高,具有NAC家族的序列特征;系统进化树分析结果显示ThNAC24与ANAC103和ANAC082的亲缘关系较近。qRT-PCR结果显示:盐胁迫下,ThNAC24基因上调表达,在根组织中胁迫12 h表达量最高,而叶组织中胁迫24 h的表达量最高;干旱胁迫下,ThNAC24基因上调表达,在根组织中胁迫6 h表达量最高,在叶组织中胁迫12 h的表达量最高。ThNAC24基因在刚毛柽柳根和叶组织中均有表达且响应盐和干旱胁迫。过表达ThNAC24基因显著降低了刚毛柽柳H_2O_2和超氧阴离子含量,增强了POD和SOD酶的活性,从而减少活性氧(ROS)的积累。过表达ThNAC24基因能够降低刚毛柽柳在逆境胁迫下的电解质渗透率、失水率及MDA的积累,从而保护细胞膜结构的完整性。【结论】刚毛柽柳ThNAC24基因能够响应盐、干旱胁迫,过表达ThNAC24基因植株通过增强POD和SOD活性,进而提高ROS清除能力,减少细胞受损或死亡,从而提高刚毛柽柳的耐盐及抗旱能力。