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[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
王晓雪 蒋湘宁 陆海
通过对毛白杨中的4-香豆酸:辅酶A连接酶1(Pt4CL1)蛋白第338位缬氨酸进行缺失突变,从而获得了具有芥子酸催化活性的Pt4CL1蛋白突变体338dVal。与野生型4CL1蛋白活性相比较,该突变体获得了催化芥子酸的活性,比活力是(1.62±0.34)nkat/mg。同时,对4-香豆酸催化活性有轻微的降低(约降低12%),对咖啡酸的催化活性有明显增加(约增加126%),对阿魏酸的催化活性有部分的降低(约降低29%),对肉桂酸的催化活性没有显著变化。该结论证实了第338位缬氨酸对底物芥子酸5位甲氧基具有空间位阻效应。该项研究为通过基因工程技术调控木质素的合成提供了新的方法。
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
范丙友 陆海 蒋湘宁
4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)催化维管植物木质素生物合成羟基肉桂酸及其衍生物辅酶A酯化合物的形成.该文对我国乡土树种毛白杨重组Pt4CL1的酶学性质进行了初步研究,结果表明:Pt4CL1在高温下不稳定,10%甘油可部分提高其温度稳定性;Pt4CL1酶学反应最适温度为40℃;Pt4CL1在pH 3.0~8.0范围内比较稳定,当pH大于8.0时其Pt4CL1的稳定性下降;最适反应pH为8.0;Mg2+是Pt4CL1最适激活剂,EDTA可抑制其活性;Tris-HCl的最适浓度为0.2 mol/L;4-香豆酸是Pt4CL1的最适底物.
[期刊] 林业科学研究
[作者]
饶国栋 张永卓 魏弘宜 蒋湘宁 陆海 张建国
为了进一步研究杨树4CL基因,以毛白杨为材料克隆到一个新的毛白杨4CL3基因。生物信息学分析结果显示:该基因和其他4CL基因一样含有4CL基因家族2个保守框Box I和Box II。将4CL3基因连接至原核表达载体pQE30,表达纯化后测定其蛋白的比活力,结果显示:4CL3基因对不同底物表现出了不同的催化效率。对该基因的最适温度和最适pH值测定后发现:4CL蛋白的最适温度为40℃,最适pH值为8.5,且在pH=9.0时有60%的活力。采用HPLC-MS的方法,分析了4CL3蛋白对混合底物的催化情况,结果显示:在混合底物下,4CL3蛋白对4-香豆酸、阿魏酸和肉桂酸都表现较高的活力,而对芥子酸和咖...
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
范丙友 胡诗宇 陆海 蒋湘宁
为了进一步研究毛白杨4CL1的酶学特性,构建了毛白杨4CL1原核表达载体pQE31--4CL1.经IPTG诱导在大肠杆菌中表达了毛白杨4CL1蛋白,SDS--PAGE电泳分析表明该新蛋白的分子量为60 kD,与预测值一致.对毛白杨4CL1蛋白在大肠杆菌中的表达体系进行了优化,确定IPTG的最佳浓度为0.4 mmol/L,诱导时的菌液密度OD600为0.3~0.5,最佳表达时间为2 h.37℃下表达的4CL1融合蛋白以包涵体的形式存在,没有生物学活性.当表达温度从37℃降低为28℃时,可溶性的有生物学活性的毛白杨4CL1蛋白诱导表达获得成功,表达量达11%.以耦联有Ni2+--NTA的琼脂糖为亲...
[期刊] 华北农学报
[作者]
郭永翠 秦江南 朱玲 张锐
为研究新疆核桃露仁机制,以露仁核桃种质温138为研究对象,其突变纸皮核桃为对照,采用RT-PCR技术克隆4CL基因并进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR方法研究核桃硬化过程中4CL基因相对表达量,找到4CL基因在露仁核桃内果皮中硬核发育过程中的表达特性。结果表明,WJ-4CL基因cDNA序列包括552 bp ORF,编码184个氨基酸,分子质量20.10 ku,理论等电点5.83;ZJ-4CL基因包含453 bp ORF,编码151个氨基酸,分子质量16.52 ku,理论等电点9.35;系统进化树表明,温138与纸皮核桃聚为同一支,其亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析表明,露仁核桃4CL基因在花后100 d的相对表达量为花后51 d相对表达量的117倍,硬壳完整核桃4CL基因在花后86 d相对表达量为花后51 d相对表达量的205倍,初步证明4CL基因在硬壳完整和露仁核桃的不同发育时期表达量存在明显差异。表明4CL基因参与核桃内果皮(硬壳)硬化过程且影响内果皮木质素的合成,从而造成核桃内果皮发育不全,出现露仁现象。
[期刊] 林业科学
[作者]
范丙友 陆海 蒋湘宁
在大多数维管植物中4CL以基因家族形式出现。4CL基因成员在植物组织中差异表达,参与不同的苯丙烷类衍生物的生物合成。4CL基因的表达受发育调控,其表达还能被环境因子激活,如各种伤害、病原菌侵染、紫外线辐射等。4CL具有高度趋异的底物偏好性及底物特异性,决定4CL同工酶底物特异性的因素可能是结合沟的空间限制而不是底物和多肽链之间的特异性相互作用。在4CL氨基酸序列中存在2个保守的肽基序(motif),肽基序BoxⅠ,SSGTTGLPKGV,肽基序BoxⅡ,GEICIRG。应用反义技术已经成功地将4CL基因用于调控模式植物拟南芥、烟草及木本植物美洲山杨、毛白杨木质素的生物合成。未来的研究应侧重以下...
关键词：
4-香豆酸:辅酶A连接酶 维管植物
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
周 王玉峰 娄来清 周华 陈素丽 蔡庆生 滕胜
通过对木质素合成途径中关键的限速酶——4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate:CoA ligase, 4CL,EC6.2.1.12)基因克隆,鉴定与时空表达分析来研究甜高粱中4CL基因家族的特性,为今后利用基因工程手段改造甜高粱木质素提供一定的理论依据。搜索NCBI数据库得到高粱中4CL基因家族序列,以甜高粱品种‘大力士’的cDNA为模版克隆得到甜高粱中4CL家族中各蛋白编码序列(CDS),CDS连入表达载体PET51B,转入大肠杆菌表达菌株(BL21)进行诱导表达,镍柱纯化后进行酶活分析。实时定量荧光 PCR(Real-time Quantitative PCR, QPCR)检测甜高...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
周 王玉锋 娄来清 周华 陈素丽 蔡庆生 滕胜
通过对木质素合成途径中关键的限速酶4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL,EC6.2.1.12)基因克隆、鉴定与时空表达分析来研究甜高粱4CL基因家族的特性,为今后利用基因工程手段改造甜高粱木质素提供一定的理论依据。搜索NCBI数据库得到高粱4CL基因家族序列,以甜高粱品种‘大力士’的cDNA为模板克隆得到甜高粱4CL家族中各蛋白编码序列(CDS),CDS连入表达载体pET51B,转入大肠杆菌表达菌株(BL21)进行诱导表达,镍柱纯化后进行酶活性分析。实时定量荧光PCR(qPCR)检测甜高粱4CL基因家族各成员在不同时期和不同组织中的相对表达量。结果表明:通过在NCBI数据库中对植物4CL蛋白序列分析...
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
刘文哲 胡学军 高晓蓉 袁晓东 刘哲 范琦 安利佳
该文利用简并寡核苷酸PCR法结合cDNA末端快速扩增PCR法从紫穗槐 (Amorphafruticosa)茎中克隆了木质素生物合成过程中重要的酶 4 香豆酸 :CoA连接酶 (4CL)的cDNA全长序列 ,避免了复杂的构建、筛选cDNA文库的过程 .所获得的全长 4CLAcDNA ,有 1911个碱基 ,包含一个完整的阅读框架 ,编码 5 4 0个氨基酸 .氨基酸序列同源性分析表明 4CLA是典型的 4CL蛋白 ,含有预计的AMP binding位点 ,接触反应区和保守的Cys.
[期刊] 林业科学
[作者]
徐煲铧 杨晓慧 李百炼 张志毅 张德强
组合利用生物信息学和RT-PCR方法,首次从毛白杨未成熟木质部cDNA中分离出PtCesA4cDNA全长,并进行测序和序列分析,结果表明克隆的毛白杨PtCesA4 cDNA片段总长为3757bp,基因内部含有完整的开放阅读框架,大小为3129bp,可编码长度为1042个氨基酸残基的蛋白质,所推导的蛋白质氨基酸序列与拟南芥AtCesA4、水稻OsCesA1和火炬松PtCesA2的蛋白质氨基酸序列同源性分别为80.3%,78.9%和75.6%。组织特异性Realtime-PCR结果显示,PtCesA4基因在杨树根、茎、叶片和顶端分生组织中均有表达,但其表达模式却不同:PtCesA4在成熟叶片、未成...
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
潘琛 任百光 盖颖
木质素是绿色植物生长发育所需的重要化合物之一。肉桂酰辅酶Ａ还原酶（ＣＣＲ）是在木质素合成过程中，催化苯丙烷类合成途径第１步的关键酶。本文以其底物之一——对香豆酰辅酶Ａ酯为例，以现有的辅酶Ａ酯合成纯化的文献报道为参考，介绍经过整合改进并不断试验而得到的ＣＣＲ底物的合成与纯化方法。从大肠杆菌中提取出来的重组酶４－香豆酸辅酶Ａ连接酶（４ＣＬ）用于合成ＣＣＲ底物，这比从植物组织中提取更易获得。提纯后的４ＣＬ可以在－８０℃下保存３、４个月。４ＣＬ反应后的产物在２个不同梯度下通过Ｃ１８反相柱进一步纯化，并用高效液相色谱仪监测。在整个纯化过程中，所有用于装载对香豆酸和对香豆酰辅酶Ａ酯的容器都用锡箔纸完全包裹．．．
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
刘亮伟 卢雪丽 胡瑜 李运锋
黑曲霉木聚糖酶xynⅢ酶分子改造时,常出现引物碱基缺失造成扩增基因移码突变.本研究将xynⅢ克隆入表达载体pET20b,分析移码突变酶C-端氨基酸序列,探讨了该碱基缺失突变的检测方法.引物中缺失1或2 bp碱基时,扩增基因产生2种移码突变酶,分别在正常酶分子C-端增加30或12个氨基酸,比正常酶分子质量分别增加6或2 ku;而缺失3 bp碱基时不产生移码突变,只比正常酶分子少1个氨基酸,含有6个H is标签;通过SDS-PAGE可将移码突变酶与正常酶分子分开,从而将移码突变基因与正常基因分开,这个理论与DNA测序结果完全吻合.同时发现2 bp碱基缺失突变是1 bp碱基缺失突变的2倍,分析了其产...
关键词：
木聚糖酶 引物 碱基缺失 移码突变 检测
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
曹山 蒋璐瑶 李丽红 要笑云 张强 撖静宜 王莹 李慧 陆海
中链酰基辅酶Ａ合成酶（ＭＡＣＳ）属于腺苷酸合成酶超基因家族，催化中链脂肪酸与辅酶Ａ结合形成相应的中链酰基辅酶Ａ。本研究通过同源检索毛果杨基因组数据库中的４ＣＬ基因，克隆得到毛果杨Ｐｔ ＭＡＣＳ１的基因序列（基因编号：ｅＳｔ ｅｘｔ＿ｆｇｅｎｅＳｈ４＿Ｐｇ．Ｃ＿６４００６６）。通过序列分析可知，Ｂｏｘ Ｉ和Ｂｏｘ ＩＩ两个在４ＣＬ中保守的结构域在该蛋白中并不保守。将Ｐｔ ＭＡＣＳ１与原核表达载体Ｐ ｅｔ－３０Ａ（＋）构建融合表达载体Ｐｔ ＭＡＣＳ１－Ｐ ｅｔ－３０Ａ（＋），转化大肠杆菌ＢＬ２１（Ｄｅ３）后诱导重组蛋白进行表达。镍柱纯化重组蛋白后进行酶学活性分析，研究结果表明该蛋白对中链脂肪酸己酸．．．
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
吴从文 鲍宝龙
为了研究金黄色葡萄球菌一氧化氮合酶的功能和作用，克隆了该基因的全长序列，在一氧化氮合酶基因缺陷菌株的基础上，构建一氧化氮合酶过表达菌株，进行表型验证，研究NO对细菌表型的影响。结果显示，一氧化氮合酶缺失使细菌自溶速率加快，抗氧化杀伤能力减弱，生物被膜生成能力降低，缺失和过表达均会影响细菌正常的生长周期和速率。外源性NO对野生菌株、敲除菌株和过表达菌株生物被膜的不同影响显示金黄色葡萄球菌一氧化氮合酶还参与了外源性NO对生物被膜的调控。一系列表型结果表明，金黄色葡萄球菌内源性NO作用不仅仅是阻断Fenton反应，增强过氧化氢酶活性，还可以作为一种信号分子调控细菌基因的转录和表达。
[期刊] 林业科学
[作者]
潘炜 田佳星 杜庆章 张志毅 张德强
利用RT-PCR方法,首次从毛白杨成熟木质部cDNA文库中分离出PtSUS1 cDNA全长,并进行了测序和序列分析。结果表明:克隆的毛白杨PtSUS1 cDNA片段总长为2703bp,基因内部含有完整的开放阅读框架,大小为2415bp,可编码长度为805个氨基酸残基的蛋白质,所推导的蛋白质氨基酸序列与拟南芥AtSUS1、水稻OsSUS1的蛋白质氨基酸序列同源性分别为83.4%,75.7%。组织特异性Realtime-PCR结果显示,PtSUS1在成熟木质部表达丰度最高,在成熟叶片、根部和正在发育的木质部表达丰度中等,在韧皮部和形成层有少量表达,在嫩叶与顶端分生组织中表达丰度最低。在此基础上,组...
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