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[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
范丙友 胡诗宇 陆海 蒋湘宁
为了进一步研究毛白杨4CL1的酶学特性,构建了毛白杨4CL1原核表达载体pQE31--4CL1.经IPTG诱导在大肠杆菌中表达了毛白杨4CL1蛋白,SDS--PAGE电泳分析表明该新蛋白的分子量为60 kD,与预测值一致.对毛白杨4CL1蛋白在大肠杆菌中的表达体系进行了优化,确定IPTG的最佳浓度为0.4 mmol/L,诱导时的菌液密度OD600为0.3~0.5,最佳表达时间为2 h.37℃下表达的4CL1融合蛋白以包涵体的形式存在,没有生物学活性.当表达温度从37℃降低为28℃时,可溶性的有生物学活性的毛白杨4CL1蛋白诱导表达获得成功,表达量达11%.以耦联有Ni2+--NTA的琼脂糖为亲...
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
范丙友 陆海 蒋湘宁
4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)催化维管植物木质素生物合成羟基肉桂酸及其衍生物辅酶A酯化合物的形成.该文对我国乡土树种毛白杨重组Pt4CL1的酶学性质进行了初步研究,结果表明:Pt4CL1在高温下不稳定,10%甘油可部分提高其温度稳定性;Pt4CL1酶学反应最适温度为40℃;Pt4CL1在pH 3.0~8.0范围内比较稳定,当pH大于8.0时其Pt4CL1的稳定性下降;最适反应pH为8.0;Mg2+是Pt4CL1最适激活剂,EDTA可抑制其活性;Tris-HCl的最适浓度为0.2 mol/L;4-香豆酸是Pt4CL1的最适底物.
[期刊] 林业科学研究
[作者]
饶国栋 张永卓 魏弘宜 蒋湘宁 陆海 张建国
为了进一步研究杨树4CL基因,以毛白杨为材料克隆到一个新的毛白杨4CL3基因。生物信息学分析结果显示:该基因和其他4CL基因一样含有4CL基因家族2个保守框Box I和Box II。将4CL3基因连接至原核表达载体pQE30,表达纯化后测定其蛋白的比活力,结果显示:4CL3基因对不同底物表现出了不同的催化效率。对该基因的最适温度和最适pH值测定后发现:4CL蛋白的最适温度为40℃,最适pH值为8.5,且在pH=9.0时有60%的活力。采用HPLC-MS的方法,分析了4CL3蛋白对混合底物的催化情况,结果显示:在混合底物下,4CL3蛋白对4-香豆酸、阿魏酸和肉桂酸都表现较高的活力,而对芥子酸和咖...
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
王晓雪 蒋湘宁 陆海
通过对毛白杨中的4-香豆酸:辅酶A连接酶1(Pt4CL1)蛋白第338位缬氨酸进行缺失突变,从而获得了具有芥子酸催化活性的Pt4CL1蛋白突变体338dVal。与野生型4CL1蛋白活性相比较,该突变体获得了催化芥子酸的活性,比活力是(1.62±0.34)nkat/mg。同时,对4-香豆酸催化活性有轻微的降低(约降低12%),对咖啡酸的催化活性有明显增加(约增加126%),对阿魏酸的催化活性有部分的降低(约降低29%),对肉桂酸的催化活性没有显著变化。该结论证实了第338位缬氨酸对底物芥子酸5位甲氧基具有空间位阻效应。该项研究为通过基因工程技术调控木质素的合成提供了新的方法。
[期刊] 华北农学报
[作者]
郭永翠 秦江南 朱玲 张锐
为研究新疆核桃露仁机制,以露仁核桃种质温138为研究对象,其突变纸皮核桃为对照,采用RT-PCR技术克隆4CL基因并进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR方法研究核桃硬化过程中4CL基因相对表达量,找到4CL基因在露仁核桃内果皮中硬核发育过程中的表达特性。结果表明,WJ-4CL基因cDNA序列包括552 bp ORF,编码184个氨基酸,分子质量20.10 ku,理论等电点5.83;ZJ-4CL基因包含453 bp ORF,编码151个氨基酸,分子质量16.52 ku,理论等电点9.35;系统进化树表明,温138与纸皮核桃聚为同一支,其亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析表明,露仁核桃4CL基因在花后100 d的相对表达量为花后51 d相对表达量的117倍,硬壳完整核桃4CL基因在花后86 d相对表达量为花后51 d相对表达量的205倍,初步证明4CL基因在硬壳完整和露仁核桃的不同发育时期表达量存在明显差异。表明4CL基因参与核桃内果皮(硬壳)硬化过程且影响内果皮木质素的合成,从而造成核桃内果皮发育不全,出现露仁现象。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
周 王玉峰 娄来清 周华 陈素丽 蔡庆生 滕胜
通过对木质素合成途径中关键的限速酶——4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate:CoA ligase, 4CL,EC6.2.1.12)基因克隆,鉴定与时空表达分析来研究甜高粱中4CL基因家族的特性,为今后利用基因工程手段改造甜高粱木质素提供一定的理论依据。搜索NCBI数据库得到高粱中4CL基因家族序列,以甜高粱品种‘大力士’的cDNA为模版克隆得到甜高粱中4CL家族中各蛋白编码序列(CDS),CDS连入表达载体PET51B,转入大肠杆菌表达菌株(BL21)进行诱导表达,镍柱纯化后进行酶活分析。实时定量荧光 PCR(Real-time Quantitative PCR, QPCR)检测甜高...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
周 王玉锋 娄来清 周华 陈素丽 蔡庆生 滕胜
通过对木质素合成途径中关键的限速酶4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL,EC6.2.1.12)基因克隆、鉴定与时空表达分析来研究甜高粱4CL基因家族的特性,为今后利用基因工程手段改造甜高粱木质素提供一定的理论依据。搜索NCBI数据库得到高粱4CL基因家族序列,以甜高粱品种‘大力士’的cDNA为模板克隆得到甜高粱4CL家族中各蛋白编码序列(CDS),CDS连入表达载体pET51B,转入大肠杆菌表达菌株(BL21)进行诱导表达,镍柱纯化后进行酶活性分析。实时定量荧光PCR(qPCR)检测甜高粱4CL基因家族各成员在不同时期和不同组织中的相对表达量。结果表明:通过在NCBI数据库中对植物4CL蛋白序列分析...
[期刊] 林业科学
[作者]
范丙友 陆海 蒋湘宁
在大多数维管植物中4CL以基因家族形式出现。4CL基因成员在植物组织中差异表达,参与不同的苯丙烷类衍生物的生物合成。4CL基因的表达受发育调控,其表达还能被环境因子激活,如各种伤害、病原菌侵染、紫外线辐射等。4CL具有高度趋异的底物偏好性及底物特异性,决定4CL同工酶底物特异性的因素可能是结合沟的空间限制而不是底物和多肽链之间的特异性相互作用。在4CL氨基酸序列中存在2个保守的肽基序(motif),肽基序BoxⅠ,SSGTTGLPKGV,肽基序BoxⅡ,GEICIRG。应用反义技术已经成功地将4CL基因用于调控模式植物拟南芥、烟草及木本植物美洲山杨、毛白杨木质素的生物合成。未来的研究应侧重以下...
关键词：
4-香豆酸:辅酶A连接酶 维管植物
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
赵朴 苏红辽 刘兴友 赵坤 胡建和 王三虎 姚四新 郑玉姝
【目的】可溶性表达猪流感病毒(SIV)NS1基因主要抗原区(NS1′)蛋白,获得具有良好抗原性的NS1′蛋白,并初步建立检测NS1抗体的斑点酶联吸附试验(Dot-ELISA)方法,为鉴别诊断猪流感病毒感染猪与疫苗免疫猪奠定基础。【方法】以质粒pET28a-NS1为模板,PCR扩增NS1基因抗原性较好的区段NS1′,用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后插入pET-32a(+),构建pET32a-NS1′,经PCR、EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切及DNA测序鉴定后,转化大肠杆菌Rosetta,用IPTG诱导表达,纯化NS1′并免疫家兔制备多克隆血清,对其进行SDS-PAGE、Western blotting...
[期刊] 水产学报
[作者]
郑清梅 叶星 白俊杰 吴锐全 劳海华 罗建仁
采用PCR方法对所克隆的斑节对虾溶菌酶基因的cDNA进行改造,并克隆至含温控启动子PRPL的大肠杆菌表达质粒pBV220,构建斑节对虾溶菌酶表达载体pBV220 lyz。该质粒转化大肠杆菌后经42℃诱导表达。SDS PAGE电泳表明,表达产物中有16kD左右的特异性条带,与预期斑节对虾溶菌酶分子量相符。薄层扫描显示,重组斑节对虾溶菌酶约占全菌总蛋白的32%,纯化后的重组斑节对虾溶菌酶占全菌可溶性蛋白的90%左右。比浊法检测复性后产物的生物活性,结果表明重组斑节对虾溶菌酶的最适pH为6.0,最适温度为40℃。测定了重组斑节对虾溶菌酶对溶壁微球菌和几种鱼病原菌菌株的溶菌活力,结果表明,重组斑节对虾...
关键词：
斑节对虾 溶菌酶基因 原核表达 溶菌活性
[期刊] 中南林业科技大学学报
[作者]
陈博雯 盖颖 蒋湘宁
肉桂酰-辅酶A还原酶(Cinnamoyl Co-A Reductase,CCR)是木质素合成中的关键酶,根据植物中CCR保守序列设计引物,以尾叶桉GLU4嫩茎为材料克隆到其CCR基因,命名为Eu CCR。该基因g DNA长2 918bp,c DNA长1 045 bp,CDS区编码336个氨基酸。EuCCR核酸序列与Gen Bank已登录的桉属植物CCR基因同源性达到96%以上,与伞房属、杯果木属植物CCR的同源性达85%以上,其编码的氨基酸序列经比对发现具有完整FR_SDR_e结构域及NADP结合位点和底物结合位点,与可可树等植物中CCR基因编码序列同源性也在84%以上,确定为CCR基因。对E...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
潘冬 张玉磊 同拉嘎 李明月 李丹 韩云飞 王海微 张忠臣 金正勋
【目的】分析不同"库"容量对水稻灌浆后期叶、茎、鞘中可溶性总糖含量及剑叶蔗糖代谢相关酶活性、Rubisco和谷氨酰胺合成酶同工型基因转录表达量的影响。【方法】选用寒地粳稻穗重型超级稻品种‘松粳9号’和穗数型高产品种‘龙稻11号’作为供试材料进行盆栽试验。在灌浆期分别进行不同剪穗处理,分别是无穗、半穗和全穗处理。【结果】表明,在同等的"源"条件下减小"库"容量有利于提高籽粒的粒重和成熟度,随着"库"容量的增加所需的灌浆时间就越长;没有"库"容时光合产物主要贮藏在叶、茎、鞘等营养器官中,但有"库"容时主要转移
[期刊] 林业科学
[作者]
徐煲铧 杨晓慧 李百炼 张志毅 张德强
组合利用生物信息学和RT-PCR方法,首次从毛白杨未成熟木质部cDNA中分离出PtCesA4cDNA全长,并进行测序和序列分析,结果表明克隆的毛白杨PtCesA4 cDNA片段总长为3757bp,基因内部含有完整的开放阅读框架,大小为3129bp,可编码长度为1042个氨基酸残基的蛋白质,所推导的蛋白质氨基酸序列与拟南芥AtCesA4、水稻OsCesA1和火炬松PtCesA2的蛋白质氨基酸序列同源性分别为80.3%,78.9%和75.6%。组织特异性Realtime-PCR结果显示,PtCesA4基因在杨树根、茎、叶片和顶端分生组织中均有表达,但其表达模式却不同:PtCesA4在成熟叶片、未成...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
徐璐 王根林
为研究可溶性腺苷酸环化酶(sAC)基因的组织特异性表达及其在不同周龄小鼠睾丸中的表达情况,探讨其在精子发生及获能中的作用,运用RT-PCR法分析小鼠sAC基因的组织表达情况及其发育的时序性变化。结果显示,sAC基因优先表达于睾丸和附睾,表达量随发育周龄的增长而呈增加趋势:于2周龄开始检测到它的表达,随后表达量显著增加至6周龄,再逐渐增长至一个平台期,呈现出发育阶段性,说明sAC在精子形成及获能过程中具有特殊作用。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
袁有美 郭清泉
以湘苎3号为材料,采用RT–PCR克隆,获得苎麻香豆酸–3–羟化酶(Bn C3H)基因的开放阅读框(ORF)序列,测序正确后将该基因片段连接到原核表达载体p ET–22b中,将构建成功的重组子p ET–22b–C3H转入BL21并诱导表达。结果显示:Bn C3H基因ORF区大小为1 536 bp,编码511个氨基酸,推测蛋白相对分子质量为57 800,理论等电点为8.61,编码的蛋白质为亲水性蛋白质;重组子在IPTG浓度为1 mmol/L时,融合蛋白的表达量在诱导2 h后达到最高,经IPTG诱导和SDS–PAGE检测,获得的融合蛋白与预期蛋白相符。
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