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[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
刘战民 陆兆新 吕凤霞 别小妹 赵海珍
采用硫酸铵分级沉淀、凝胶过滤和离子交换层析等方法,对毕赤酵母工程菌发酵液中的原果胶酶进行了分离纯化,测定了其分子质量,并确定了离子交换层析法的最佳离子交换条件。结果表明,硫酸铵的饱和度为70%时,可以使原果胶酶的回收率达到71.9%,比活力为1 096.35 U/m g;经Sephadex G 75凝胶过滤,原果胶酶回收率达到57.6%,酶的比活力提高到3 762.40 U/m g;最佳离子交换条件为:0~0.5 m o l/L N aC l(缓冲体系为N oA c-HA c,pH 5.8)溶液线性洗脱、Sepharose F ast F low离子交换层析分离,在该条件下酶的比活力提高到9 ...
关键词：
毕赤酵母 原果胶酶 分离纯化
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
许佳惠 尹雅洁 李欣悦 柳凯 梁运祥 赵述淼 胡远亮
将Brevibacillus brevis US575角蛋白酶基因kerUS进行密码子优化,并在毕赤酵母GS115中表达,以提高角蛋白酶产量。结果表明:优化的基因可在毕赤酵母中成功表达,重组角蛋白酶的分子质量约30 ku,最佳反应条件为pH 9.5和60℃,1 mmol/L的Mn~(2+)、Ba~(2+)对角蛋白酶活性有促进作用。此外,重组角蛋白酶易降解干酪素和β角蛋白(羽毛粉),酶促反应最大速度v_(max)=0.019 g/(L·min),K_m=4.64 g/L,比活力=440 U/mg。研究获得的产角蛋白酶重组毕赤酵母具有较好的应用前景。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
马冬梅 白俊杰 简清 劳海华 叶星 罗建仁
为进一步开展重组中华鲟(Acipenser sinensis)半胱氨酸蛋白酶抑制剂cystatin功能分析和应用研究,进行了诱导方式、诱导时间和培养基pH值对该重组菌的表达量的影响研究。结果表明,用直接诱导法,在诱导72 h、pH值为6.5、甲醇终浓度为0.5％的条件下,对重组酵母进行诱导最为合适,重组cystatin表达量可达每升培养基215 mg,约占培养基上清总蛋白量的76.3％。经离子交换层析法纯化,重组cystatin的纯度可达94.2％。生物活性检测试验表明。该方法提取的重组cystatin对木瓜蛋白酶的活性具有明显的抑制作用。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
李英华 白俊杰 简清 叶星 李新辉 罗建仁 梁旭方
取本室构建的鲤生长激素毕赤酵母工程菌GS115 (pPICZαA -GH) ,甲醇诱导 ,SDS -PAGE检测 ,证明重组鲤生长激素 (RecombinantCarpGrowthHormone ,rcGH)在酵母中得到分泌表达。重组酵母菌生长曲线显示 ,细胞从培养第 8小时进入对数生长期 ,至 32hOD660 升至峰值 11.5 ,此后OD660 缓慢下降。在以 10 0 %甲醛按 0 .5 %添加量诱导至 72h、pH为 6 .0时 ,rcGH表达量最高。凝胶扫描分析 ,分泌表达的rcGH占上清总蛋白的 36 .4 1% ,表达量为 30 0～ 4 0 0mg/L发酵液。经离子交换层析法...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
李立恒 谢达平 兰时乐
寄生于南方亚麻茎杆上的环状芽孢杆菌发酵产生的果胶酶和木聚糖酶经采用(NH4)_2SO_4沉淀与半透膜透析,CM-Sephadex C-50凝胶离子交换柱层析,Sephadex G-100凝胶柱层析分离纯化.经鉴定果胶裂解酶和木聚糖酶基本达电泳纯,果胶裂解酶两个亚基的相对分子质量分别为32253,27400,木聚糖酶两个亚基的相对分子质量分别为86 489,57422;果胶裂解酶和木聚糖酶最适反应温度为45℃;果胶裂解酶最适反应pH值为10.5,木聚糖酶最适反应pH值为7;对果胶裂解酶而言,K~+,Mg~(2+)有轻度的抑制作用.Fe~(2+),Cu~(2+)有强抑制作用,Ca~(2+)有一定的...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
郝孔利 张子辉 王珊珊 张杰
从喂食聚乙烯塑料印度谷螟(Plodia interpunctella (Hübener))幼虫的肠道液中分离筛选出1株能还原Cr(Ⅵ)的酵母菌ZJH-1,通过形态特征和分子生物学鉴定该菌株为季也蒙毕赤酵母菌(Pichia guilliermondii)。该菌株对Cr(Ⅵ)的最小抑菌浓度(MIC)为17mmol/L,在含有50mg/L Cr(Ⅵ)的条件下,对其他重金属的MIC分别为Cu(Ⅱ)13 mmol/L、Pb(Ⅱ)6 mmol/L、Ag(Ⅰ)4 mmol/L、Mn(Ⅱ)16 mmol/L、Ni(Ⅱ)3mmol/L、Co(Ⅱ)3mmol/L、Cd(Ⅱ)0.9mmol/L和Hg(Ⅱ)0.2mmol/L。以Cr(Ⅵ)还原率为指标,考察了温度、pH、接种量、供电子体以及不同重金属离子对Cr(Ⅵ)还原率的影响,结果表明:在酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基(YPD)中,菌株ZJH-1还原Cr(Ⅵ)的较优pH和温度分别为9.0和40℃;在最适条件下,接种量为8%时,Cr(Ⅵ)的还原效果最佳;当葡萄糖作为供电子体时,48h内Cr(Ⅵ)的还原率为100%;菌株在含有不同重金属离子的培养液中,除Cu(Ⅱ)、Pb(Ⅱ)和Co(Ⅱ)外,菌株ZJH-1还原Cr(Ⅵ)的能力和生长能力均受到抑制,抑制顺序为Mn(Ⅱ)>Hg(Ⅱ)>Ag(Ⅰ)>Ni(Ⅱ)>Cd(Ⅱ)。对菌株ZJH-1还原Cr(Ⅵ)能力的初步研究结果表明,菌株ZJH-1在Cr(Ⅵ)污染修复中具有良好的应用潜力。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
周仕春 邵继荣
黑曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）Ｓ２１经波长２６６ｕｍ，照射剂量８ｍｊ的激光处理４０秒，获得一高产果胶酶突变株ＳＭ４０－６。以果胶为底物培养，该突变株发酵滤液，初筛酶活力达８５４μ／ｍｌ；比出发菌及对照提高２倍。液体发酵工艺条件研究表明，该菌产酶最适培养基组成为甘薯与麦比１∶４，硫胺２％。最适培养条件为：ｐＨ３．５，温度３０℃，培养时间８４小时。
关键词：
果胶酶,黑曲霉,发酵,诱变
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
周洁 陈鑫 郑祥梓 林成增 王宗华 鲁国东
本研究从稻瘟病菌菌株Guy11中提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增到一假定几丁质酶基因MGG_08054.6的cDNA序列,将其亚克隆至带有His-tag标签的酵母表达载体pPIC3.5K中,构成重组质粒pPIC3.5K-ws,电击转化至毕赤酵母菌菌株GS115,通过MD-MM平板筛选及PCR验证获得重组酵母转化子GS115-PICH-ws;阳性转化子在甲醇诱导下,成功分泌出重组蛋白.SDS-PAGE分析表明,重组蛋白分子质量为48 ku,与其理论计算值基本相符;Ni-NTA法分离纯化后的重组蛋白经DNS法测定具有几丁质酶活性.
关键词：
稻瘟病菌 几丁质酶 毕赤酵母 表达
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
李雯 陶妍
从鲤鱼鳃组织中分离克隆到一种新的g型溶菌酶同工型基因(CLYG).该基因的全长cDNA为558 bp,除去终止密码子,编码185个氨基酸,推断的氨基酸序列没有信号肽,含3个催化位点(谷氨酸73、脯氨酸86和天冬氨酸97),具有鱼类g型溶菌酶的基本特征.通过PCR方法在CLYG基因的5'和3'端分别引入XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点.扩增到的目的片段与表达载体pPICZαA连接构建重组表达载体pPICZαA-CLYG后,电转至毕赤酵母X-33,筛选得到的阳性转化子在1.0%甲醇、29℃、pH 6.0的条件下诱导
关键词：
鲤鱼 g型溶菌酶 毕赤酵母 重组表达
[期刊] 中国农业科学
[作者]
马捷 刘延琳
【目的】构建具有较高胱硫醚β-裂解酶活性的葡萄酒酵母工程菌株,用于提高葡萄酒的香气品质。【方法】利用质粒pAUR123将大肠杆菌tnaA基因在中国本土酿酒酵母菌株LFP525中进行表达,得到的转化子进行酶活测定,并通过模拟汁和干白的发酵,评价其酿酒特性和产生硫醇类物质的能力。【结果】成功获得酵母工程菌株TH1和TH2,其胱硫醚β-裂解酶活性与受体菌比提高了32.25%-59.44%。模拟葡萄汁发酵显示,工程菌株中硫醇类物质的产量显著提高,是受体菌的2.8-4.3倍。工程菌株的发酵时间比受体菌略长,残糖和挥发酸显著高于宿主菌,但其含量处于正常范围。在长相思干白发酵试验中,该工程菌株的主要酿酒特性...
关键词：
酿酒酵母 胱硫醚β-裂解酶 硫醇
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
李潇楠 王爽 王琦
为得到高表达超氧化物歧化酶毕赤酵母工程菌株,促进SOD的产业化生产,将来源于蜡样芽孢杆菌M22菌株的Mn-SOD-2基因转入毕赤酵母GS115中,构建了表达工程菌株YS 1～100。采用PTVA法(Posttransformational vector amplification)进行拷贝数扩增处理。建立了SOD重组菌株MMH(Minimal Methanol+Histidine)平板简易检测法,使用该法对转化子进行初筛,并用荧光定量PCR(Fluorescence quantitative PCR)法检测部分重组酵母工程菌中外源SOD基因的拷贝数。结果表明:试验中得到80株高抗Zeocin的...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
胡爱红 陈丽芝 史宝军 王卫卫
采用DNS法对基因工程菌毕赤酵母所产的木聚糖酶进行测定,研究其最适反应pH,最适反应温度,好;Mg2+,Zn2+,Ca2+对木聚糖酶活性有促进作用;Cu2+,Ba2+,Fe3+等对木聚糖酶有一定的抑制作用.TLC,金属离子对酶活性的影响等酶学性质,采用薄层层析TLC和高效液相色谱法HPLC对该酶的酶解产物进行了分析,结果表明,该木聚糖酶的最适pH值为4.5,在pH3.5~6.0稳定;最适反应温度为55℃,耐热稳定性良HPLC测定结果显示,木聚糖酶酶解产物主要以木二糖、木四糖等低聚糖为主,而木糖含量很低;该木聚糖酶是相对单一的内切木聚糖酶.
关键词：
木聚糖酶 酶学性质 底物降解
[期刊] 华中师范大学学报(自然科学版)
[作者]
张琪 吴秀菊 俞婷 王志林 崔百元 朱庆锋 贝锦龙
为系统评估重组毕赤酵母植酸酶的N-糖基化充分性,建立了一种通过联用高效液相色谱-串级质谱来分析植酸酶氨基酸序列及N-糖基化位点的技术.分别发酵了3株基因组已整合不同植酸酶基因的毕赤酵母.发酵液上清经离子交换与凝胶过滤后获得纯化的植酸酶.使用PNGase F或Endo H脱糖基化酶处理植酸酶后,用胰蛋白酶消化脱糖基化产物.通过纳升级高效液相色谱分离胰蛋白酶切产生的肽段混合物.并在联用的串级质谱上进行肽段测序与N-糖基化位点鉴定.结果显示3种植酸酶蛋白的可检测序列覆盖率均在69%以上,且与文献报道不同,均存在糖基化位点修饰不充分的现象.本实验结果证明了高效液相色谱-串级质谱联用法检测植酸酶N-糖基化位点的有效性,并为植酸酶的糖基化研究提供了新的基础.
关键词：
植酸酶 N-糖基化 质谱 毕赤酵母
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
唐升斌 矫庆华 谢达平
通过PCR方法扩增得到无信号肽无内含子的酸性植酸酶phyB基因,将此基因克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9K上,并转化毕赤酵母GS115感受态细胞,获得重组毕赤酵母.在甲醇的诱导下,该植酸酶phyB基因在毕赤酵母中得到表达.经SDS-PAGE凝胶电泳分析,该重组蛋白的相对分子质量为7.5×104,而该植酸酶在大肠杆菌DH5α表达系统中表达的相对分子质量为6.0×104,这可能是由于糖基化的结果.酶学性质检测发现,表达的植酸酶最适作用温度为65℃,比野生原始菌株的提高了10℃;诱导pH值为5.5时,蛋白的表达量最高,为10 528.6 U/mL,是野生菌株的2.8倍;最适作用pH值为2.5;在70...
[期刊] 华北农学报
[作者]
宋玛丽 王茜 杜军 赵峰梅 梁爱华
对来源于大肠杆菌的植酸酶基因ａｐｐ ａ进行突变获得植酸酶基因突变体ａｐｐ ａ－２ＱＮ，利用酵母表达系统在摇瓶培养条件下表达后，该植酸酶突变体显示出良好的热稳定性。为提高该植酸酶的表达量，降低植酸酶的生产成本，对表达该酶的重组酵母菌ＧＳ１１５／ａｐｐ ａ－２ＱＮ进行了高密度发酵研究，通过控制发酵过程中碳源（甘油）的添加使得菌体生长达到一定密度，从而实现高效表达。在诱导蛋白质表达阶段，发酵液中甲醇的含量影响植酸酶的表达量，利用变色酸分光光度法对甲醇含量进行了检测分析。结果表明，在５ Ｌ发酵罐中进行高密度发酵１４７ ｈ后，菌体浓度ＯＤ６００Ｎｍ达到３１３，通过将甲醇浓度控制在２．５％左右，经过诱导１．．．
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