以欧美杨为材料，通过ＲＴ－ＰＣＲ方法从欧美杨叶片中克隆到了抗旱脱水素ＤＨＮ２ｂ基因（命名为ＰＤＤＨＮ２ｂ），该基因开放阅读框为１４４０ ｂＰ，编码３７９个氨基酸，绝大多数氨基酸组成属于亲水性氨基酸，无明显跨膜结构域。亚细胞定位表明ＰＤＤＨＮ２ｂ基因定位在细胞质或细胞膜上。荧光定量ＰＣＲ分析表明：该基因在顶端中表达量最高，功能叶、根和茎中则无表达。同时该基因受ＮａＣｌ、ａｂａ和干旱等诱导表达。另外，构建了原核表达载体ＰＥＴＰＤＤＨＮ２ｂ，并在大肠杆菌ｂｌ２１中表达融合蛋白，诱导纯化后免疫小白鼠，制备抗体。ＳＤＳ－ＰａＧＥ电泳结果表明，融合蛋白分子量为５８ｋｕ。最后利用Ｎｉ－ＮＴａ纯化的ＰＤＤＨＮ．．．

以欧美杨为材料,通过RT-PCR方法从欧美杨叶片中克隆到了抗旱脱水素DHN2b基因(命名为PdDHN2b),该基因开放阅读框为1440 bp,编码379个氨基酸,绝大多数氨基酸组成属于亲水性氨基酸,无明显跨膜结构域。亚细胞定位表明PdDHN2b基因定位在细胞质或细胞膜上。荧光定量PCR分析表明:该基因在顶端中表达量最高,功能叶、根和茎中则无表达。同时该基因受NaCl、ABA和干旱等诱导表达。另外,构建了原核表达载体pETPdDHN2b,并在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白,诱导纯化后免疫小白鼠,制备抗体。SDS-PAGE电泳结果表明,融合蛋白分子量为58ku。最后利用Ni-NTA纯化的PdDHN...

欧美杨是中纬度地区最适合的短轮伐期工业用材集约经营树种之一,然而盐渍、干旱和低温严重影响了欧美杨的生长发育和产量。本文利用RT-PCR等技术克隆出欧美杨PP2C基因并进行了序列分析。Pd PP2C基因开放阅读框为1 320 bp,编码439个氨基酸。蛋白质序列分析表明,PP2C蛋白N端保守性不强,C端有保守的蛋白磷酸酶区域。荧光定量PCR分析表明,该基因在欧美杨根、成熟叶、顶端叶和茎中都有表达且根中表达量最高。逆境胁迫分析表明,该基因受Na Cl、ABA和干旱等诱导表达。干旱和盐胁迫处理下转Pd PP2C基因拟南芥与野生型相比生长受到较少抑制,且叶绿素含量上升,丙二醛含量下降,表明Pd PP2...

利用同源克隆方法首次从欧美杨雄花序克隆到1个R2R3-MYB基因PeMYBF1。序列分析结果显示:该基因编码的蛋白质具有典型R2R3-MYB转录因子序列特征,即N端含有2个由53个氨基酸组成的MYB结构域,暗示PeMYBF1是1个欧美杨R2R3-MYB转录因子家族的新成员。聚类分析表明:PeMYBF1归属为第19亚组,该亚组成员在花发育过程中发挥重要作用。器官特异性表达模式分析结果显示:PeMYBF1特异在雄花序和雌花序中表达,暗示PeMYBF1可能参与欧美杨花发育的调控。进一步的分析结果显示:PeMYBF1在不同发育时期花序中的表达水平受到严格调控。

为研究沙冬青脱水素的功能,根据沙冬青cDNA文库中脱水素基因序列设计引物,采用PCR技术进行了脱水素基因的扩增,扩增产物与载体pGM-T载体连接,转化大肠杆菌Top10,筛选阳性克隆,测序结果表明,已成功克隆的阳性重组子经测序鉴定其片段大小与已知沙冬青cDNA文库中脱水素基因大小一致,为760 bp,说明此序列无内含子。将成功克隆的阳性重组子提取质粒与pCAMBIA3301质粒同样进行酶切反应,再以T4DNA连接酶连接,成功构建了脱水素基因的植物表达载体,为下一步的抗逆性研究打下了基础。

【目的】通过对棉花脱水素基因结构特征及其在低温胁迫下表达模式进行分析，探讨脱水素在棉花响应低温过程中的功能，为棉花抗冷育种提供理论基础。【方法】以棉花抗冷品种豫２０６７为试验材料，根据棉花陆地棉基因组序列查找已知脱水素（ｄｅｈｙｄｒｉｎ，ｄｈｎ）基因的ＣｄＳ序列，利用Ｐｒｉｍｅｒ５软件设计引物，克隆该基因，并命名为Ｇｈｄｈｎ１；采用生物信息学方法分析其蛋白质性质、氨基酸含量特征、功能结构域、系统进化树；选择ＸｂａⅠ和ＳｍａⅠ酶切位点对植物表达载体Ｐ ｂｉ１２１：：ＧＦＰ进行双酶切，采用ｉｎ－ＦｕＳｉｏｎ连接技术构建融合蛋白瞬时表达载体Ｐ ｂｉ１２１－Ｇｈｄｈｎ１：：ＧＦＰ；分析其在洋葱表皮细胞．．．

【目的】对小麦类脱水素基因进行克隆与分析,为深入研究植物脱水素的结构及其在耐旱中的可能功能提供理论依据。【方法】利用PEG胁迫处理小麦幼苗,采用RACE方法,从干旱诱导的郑引1号小麦中获得脱水素基因,采用生物信息学方法对该基因进行耐旱功能分析。【结果】获得了小麦脱水素基因新成员WZY2的全长序列,其长度为849 bp,含1个459 bp的开放阅读框,编码152个氨基酸。该氨基酸序列具有明显的脱水素类蛋白特征(K片段),由2个K片段、1个S片段和1个Y片段组成,属于YSK2型脱水素。该脱水素具有较高的亲水性,表明该蛋白在束缚自由水、稳定膜结构方面有一定作用。【结论】从水分胁迫的郑引1号小麦中克隆...

为了探究菘蓝IiCYP79B2基因的结构、特性和功能,对菘蓝IiCYP79B2基因进行了克隆,并进一步开展了生物信息学分析和不同条件下的表达模式研究。相关研究结果显示:IiCYP79B2基因全长1 827 bp,包含1个内含子,ORF全长1 629 bp,编码542个氨基酸。其编码的蛋白含有2个跨膜结构域,无信号肽,定位于叶绿体类囊体膜上,属于主要由无规则卷曲和α-螺旋构成的亲水性蛋白,与白芥的亲缘关系最近。qRT-PCR分析结果表明:IiCYP79B2基因在菘蓝各组织中的表达量由高到低依次为叶>茎>果>花>根,在不同发育时期的表达量依次为营养生长期>花期>幼苗期>萌芽期;此外,该基因的表达还显著响应茉莉酸甲酯(MJ)和葡萄糖(Glu)信号的诱导,受到水杨酸(SA)和低温(Cold)胁迫的抑制。相关研究结果为进一步探讨IiCYP79B2基因的功能提供了有效的试验依据。

【目的】克隆小黑杨(Populus×xiaohei T.S.Hwang et Liang)RAV1和RAV2基因,分析这2个基因在非生物胁迫下的表达模式,为进一步研究小黑杨基因功能提供理论依据。【方法】以抗逆性强的小黑杨根为试材,克隆2个RAV家族成员。利用生物信息学方法对小黑杨2个RAV基因的理化性质、保守基序、保守结构域、系统进化进行分析,并采用半定量RT-PCR方法探讨这2个基因在小黑杨顶芽、叶、木质部、韧皮部、根、第1～14片叶、第1～11茎节中的表达情况,以及在CdCl_2、NaCl、NaHCO_3、PEG和ABA胁迫下的表达特性。【结果】从小黑杨中克隆出2个RAV基因,命名为PsnRAV1和PsnRAV2。PsnRAV1编码405个氨基酸,预测分子质量约为99.46 ku,等电点5.06,不存在信号肽;PsnRAV2编码407个氨基酸,预测分子质量约为99.33 ku,等电点5.06,存在信号肽;2个基因均位于细胞核上。保守结构域和保守基序分析结果表明,小黑杨RAV蛋白具有RAV家族特有的AP2和B3这2个保守蛋白结构域,基序1、2、3是构成2个结构域的主要基序。系统进化分析表明,20种植物的RAV蛋白分为3组,其中PsnRAV1和PsnRAV2与毛果杨(Populus trichocarpa)RAV同源性很高。半定量RT-PCR分析结果显示,2个PsnRAVs基因在小黑杨的顶芽、叶、木质部、韧皮部和根中均有表达;且随着叶和茎的发育,2个基因的表达量均呈现升高的趋势。在CdCl_2、NaCl、Na HCO_3模拟的重金属及盐胁迫下,2个基因的表达模式虽不相同,但在根部均受到诱导;在PEG模拟的干旱胁迫下,PsnRAV1和PsnRAV2在叶片和根部均有响应,其中在根部受到的诱导更为明显,尤以PsnRAV2的表达更为显著;此外,PsnRAV1和PsnRAV2也受到ABA的诱导,其在叶中的表达量在初期表现为上升,而后期下降。【结论】2个PsnRAVs基因与小黑杨的抗逆性密切相关,可能参与了小黑杨的非生物胁迫应答,其中PsnRAV2在胁迫下的作用更为显著。

为了解蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）在生物体细胞周期调控过程中的作用，本文采用RACE技术克隆了近缘新对虾（Metapenaeus affinis）PP2A-B55基因，并使用qRT-PCR初步探究其在卵巢发育过程的作用。通过RACE扩增得到了MaPP2A-B55基因的cDNA序列全长，共2 100 bp，其中ORF为1 332 bp，编码443个氨基酸，预测分子量为51.229 kDa，理论等电点为6.04。多重比对表明MaPP2A-B55与凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）和斑节对虾（Penaeus monodon）的PP2A-B55的氨基酸序列一致性最高，系统进化树显示与凡纳滨对虾、斑节对虾和日本囊对虾（Marsupenaeus japonicus）具有较近的亲缘关系。定量结果表明MaPP2A-B55在肌肉和卵巢显著表达，同时在卵巢发育过程中的表达量存在显著差异，在幼体发育时期的受精卵阶段呈高表达，然后下降，在无节幼体Ⅵ期降到最低点，溞状幼体Ⅰ期开始上升之后表达平稳。研究结果显示PP2A-B55可能参与了近缘新对虾的卵巢成熟与幼体发育过程。

【目的】深入挖掘巨桉脱水素基因EgrDHN家族成员并探讨其应对逆境胁迫的表达模式，从中筛选具有抗逆功能的EgrDHN基因对于培育桉树抗逆新品种具有重要意义。【方法】以巨桉全基因组数据为参考，利用生物信息学筛选鉴定得到巨桉EgrDHN基因家族成员，对其进行生物信息学分析，具体包括进化树分析、蛋白序列比对、启动子顺式作用元件预测等，并基于生信分析结果，对EgrDHN基因家族成员进行低温、高盐和ABA胁迫处理，采用RT-qPCR测定其表达模式，同时对其组织表达特异性进行了测定。【结果】从巨桉基因组中共鉴定出EgrDHN家族9个成员，将其命名为EgrDHN1～EgrDHN9，分布于5条染色体上，根据蛋白质保守序列的特点可分为K_nS、SK_n和Y_nSK_n 3种类型。系统进化树显示植物DHN家族成员可分为4个进化枝，其中第Ⅳ进化枝包含巨桉EgrDHN7、EgrDHN8、EgrDHN9，但不包含任何毛果杨Populus trichocarpa DHN同源基因（PtrDHNs），两者存在明显差异。启动子元件预测分析发现巨桉EgrDHN启动子中含有低温响应（low-temperature response,LTR）等胁迫响应类元件，MYB、MYC等与抗逆性相关以及植物激素响应类顺式作用元件。组织特异性表达分析发现EgrDHN家族成员在根、成熟叶片、子叶中表达量较高，其中EgrDHN2在成熟叶片中表达量最高。非生物逆境胁迫下经RT-qPCR检测发现EgrDHN家族成员中，EgrDHN1在高盐胁迫下表达量下调，在低温和ABA胁迫时上调，而其他成员在低温、高盐、ABA胁迫下均存在上调，其中低温条件下以EgrDHN2、EgrDHN3、EgrDHN4响应最为明显。【结论】大部分EgrDHNs基因参与逆境胁迫响应，且除EgrDHN1在盐胁迫下的表达量下降外其它成员在逆境胁迫下的表达量均上升。

植物在受到高温、低温、干旱和盐害等逆境胁迫时,ERF作为信号转导因子被诱导并调控其他抗逆基因的表达。研究茶树AP2/ERF-B3类转录因子在不同茶树品种间的分子特性、组织表达和逆境响应情况,将有助于了解AP2/ERF转录因子在茶树逆境调控中的作用。以2个茶树品种‘安吉白茶’和‘迎霜’为试验材料,通过RT-PCR方法分别从2种茶树的cDNA中克隆得到CsERF-B3基因。利用实时定量PCR技术检测该基因在茶树根、茎、叶、花各组织和4种非生物逆境胁迫处理(4℃低温、38℃高温、200 g·L-1PEG干旱处理、200 mmol·L-1NaCl)中的表达情况。结果表明:2种茶树中CsERF-B3基因...

【目的】从‘大嵌蒂’果梅中克隆PmKNAT2,并对其结构特征及表达模式进行分析,为研究果梅雌蕊败育的分子机理和分子育种奠定基础。【方法】在NCBI中查找与果梅相似性很高的桃KNOPE2(KNAT2的同源基因)序列(EF093491),根据桃的KNOPE2序列设计特异引物;采用改良CTAB法提取‘大嵌蒂’果梅花芽总RNA;通过RT-PCR和RACE技术获得基因cDNA序列全长;使用DNAMAN软件进行序列拼接;利用NCBI数据库中的BLASTn和BLASTp程序进行相似性分析;通过生物信息学方法分析结构特征;用DNAMAN软件分析基因的ORF和氨基酸序列;MEGA4.0软件进行系统进化树的构建;...

【目的】克隆鸡纤维蛋白原样蛋白2(fibrinogen-like protein 2,FGL2)基因,并进行生物信息学分析和原核表达,为鸡FGL2蛋白的功能研究奠定基础。【方法】采用逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)技术扩增鸡FGL2基因,克隆至pMD19-T载体,测序后对鸡FGL2基因及其编码的蛋白进行生物信息学分析。构建原核表达质粒pET-32a-FGL2,将其转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。【结果】成功克隆了鸡FGL2基因的CDS区,序列全长为1 320 bp,编码439个氨基酸。生物信息学分析显示,鸡FGL2氨基酸与火鸡、雉鸡、珍珠鸡、鹌鹑等禽类的同源性高,达96%以上;与哺乳类动物的同源性较低,其中与犬的同源性仅有64.8%。FGL2蛋白由439个氨基酸组成,理论分子质量为50.24 ku,分子式为C_(2 221)H_(3 451)N_(615)O_(673)S_(22),理论等电点(pI)为8.63,为不稳定的亲水性分泌型蛋白,无跨膜区。成功构建了原核表达质粒pET-32a-FGL2,其在大肠杆菌BL21(DE3)可表达以包涵体形式为主的FGL2融合蛋白,分子质量约为70 ku。【结论】成功克隆出了1 320 bp的鸡FGL2基因,明确了其编码蛋白的生物学信息,经诱导表达后获得FGL2重组蛋白。

本研究采用RACE末端扩增方法,得到全长为3872bp的圆斑星鲽(Verasper variegatus)piwil2基因序列,命名为Vvpiwil2,开放阅读框(ORF)长为3192bp,编码1063个氨基酸,5’-UTR和3’-UTR的长度分别140 bp和540 bp。基于ExPASy、SMART、Signal4.1和NCBI的保守结构域(CDD)数据库在线分析对蛋白序列结构进行预测,推断Vvpiwil2编码的氨基酸分子量为118.6 kDa,理论等电点为9.02,无跨膜结构及信号肽,有3个结构域:ArgoL1结构域、PAZ结构域及PIWI结构域。利用实时荧光定量PCR技术对圆斑星鲽不同发育时期的胚胎、仔稚鱼以及雌雄成鱼的不同组织表达模式进行分析。结果显示,Vvpiwil2基因从胚胎发育早期至高囊胚期均大量表达,之后呈下降趋势,直至孵化阶段。由于胚胎从卵裂至囊胚时期的发育过程主要受细胞质成分引导,直至原肠早期,mRNA开始大量转录合成,实现由母源型向合子型的过渡,推断Vvpiwil2是母源性基因。孵化后仔稚鱼68 d时,Vvpiwil2基因表达量显著高于其他时期,表明Vvpiwil2的功能可能与圆斑星鲽性腺分化过程相关;Vvpiwil2基因在雌雄成鱼性腺中的表达量显著高于其他组织,且卵巢中的表达量显著高于精巢,推测Vvpiwil2基因在卵巢功能的维持中发挥重要作用。本研究结果为解析圆斑星鲽性别决定机制提供了新的靶标基因,为建立全雌化苗种繁育技术打下坚实的理论基础。