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[期刊] 水产学报
[作者]
姚志刚 冯建军 王艺磊 郭松林 林鹏 张子平 张在鹏
髓样分化因子(myeloid differentiation factor 88,My D88)是TLR(toll-like receptor)信号通路的关键接头蛋白,在先天性免疫中发挥重要作用。实验首次克隆了欧洲鳗鲡My D88基因c DNA全长序列,命名为Aa My D88,其全长为1 539 bp,开放阅读框为846 bp,编码282个氨基酸。该蛋白三维丝带空间结构图与人类的My D88十分相似,具有My D88家族典型的死亡结构域和TIR(toll-like/IL-1 receptor)结构域,其中TIR结构域中含有3个序列高度保守的box1、box2和box3。同源性分析显示,欧洲鳗...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
冯建军 郭松林 林 鹏
通过RTGPCR技术克隆欧洲鳗鲡(Anguillaanguilla)Ig轻链基因c DNA全长序列,命名为Aa Ig L,其全长为1016bp,开放阅读框为714bp,编码238个氨基酸.将该基因片段与p ETGhis载体连接构建原核表达载体,在大肠杆菌BL21中诱导表达,其表达产物经SDSGPAGE和Westernblotting分析,结果表明新增的27ku蛋白条带与预期值相符,且与兔抗欧洲鳗鲡Ig M血清发生特异性显色反应,证实了Aa Ig L基因能够在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达;实时荧光定量PCR检测结果发现:Aa Ig L在欧洲鳗鲡各组织中均有表达,其中脾脏的表达量最高,肾脏和心脏...
[期刊] 水产学报
[作者]
徐元凯 彭欣慰 林鹏 王艺磊 冯建军
为了阐明鱼类TANK结合激酶1（TBK1）在免疫应答密切相关的NF-κB、I型IFN及MAPK信号通路中的调控作用，本实验通过cDNA末端快速扩增技术（SMARTRACE）从日本鳗鲡中克隆了TBK1基因cDNA全长序列，命名为AjTBK1，利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测了在体和离体状态下不同病原体相关分子模式（PAMPs）及嗜水气单胞菌对日本鳗鲡AjTBK1基因表达水平变化的影响，通过构建绿色荧光蛋白pEGFP-TBK1和pCMV-TBK1真核表达质粒对AjTBK1亚细胞定位以及AjTBK1过表达对NF-κB、AP-1、IFN-β启动子荧光素酶活性的激活作用进行研究。蛋白质序列分析显示，日本鳗鲡AjTBK1编码731个氨基酸，其三维丝带空间结构与人类TBK1相似，具有保守的激酶结构域（KD）、泛素样结构域（ULD）、二聚化支架结构域（SDD）以及C端结构域（CTD），在系统发育树中与其他鱼类TBK1家族聚为一支。qRT-PCR检测发现AjTBK1在多种组织中广泛表达，且在肝脏和肠中高表达。经LPS、poly I:C、嗜水气单胞菌免疫注射后，AjTBK1基因表达水平在日本鳗鲡肝脏中显著提高，而肾脏中的表达量则在LPS和poly I:C刺激后显著降低。离体实验中，经LPS、poly I:C、PGN以及不同浓度嗜水气单胞菌刺激后的日本鳗鲡肝脏细胞AjTBK1基因表达水平均有显著升高。亚细胞定位结果显示天然状态下的AjTBK1在HEK293细胞质中分布，经LPS和poly I:C刺激后呈聚集点状分布。此外，双荧光素酶活性检测发现过表达的AjTBK1可显著增强NF-κB、AP-1和IFN-β启动子荧光素酶活性。以上研究表明AjTBK1可以通过激活NF-κB、AP-1和I型IFN信号通路，在机体抗细菌和抗病毒先天免疫应答中发挥重要的调控作用。
[期刊] 海洋渔业
[作者]
李英英 陈曦 杨金先 陈强 宋铁英 葛均青
为了研究欧洲鳗鲡（Anguilla anguilla）RIG-I基因的特性，本实验通过设计引物，扩增其序列，克隆至pCE2-TA/Blunt-Zero载体，测序验证后对所获得欧洲鳗鲡RIG-I基因序列进行生物信息学分析及原核表达。结果表明，欧洲鳗鲡RIG-I基因ORF序列有2 823 bp碱基，编码940个氨基酸，与日本鳗鲡（A. japonica）的序列同源性为96.71%；RIG-I蛋白属酸性亲水性蛋白，不存在跨膜结构，无信号肽，较不稳定，主要分布于细胞质中，有6个保守功能区；SDS-PAGE和western blot结果显示，实现了RIG-I基因在大肠杆菌中的高效表达，为后期制备RIG-I多克隆抗体，进一步探索RIG-I介导的天然免疫在鳗鲡抵御鳗鲡疱疹病毒（Anguillid herpesvirus， AngHV）侵染过程中的作用机制提供研究基础。
[期刊] 水产学报
[作者]
林娟娟 杨金先 陈强 俞伏松 刘晓东 林天龙
应用亲和层析技术提纯欧洲鳗鲡免疫球蛋白(Ig),并对欧鳗Ig的结构和抗原性进行分析。层析结果表明:Ig蛋白呈现一个锐形曲线,蛋白峰与抗原活性峰高度重叠。SDS-PAGE分析表明:欧鳗Ig重链分子量为68kD,轻链有3条,分子量分别为21kD、23kD和26kD。凝胶电泳结果显示:在非变性非还原条件下,欧鳗Ig有790kD和350kD2条蛋白带,在变性非还原条件下有790kD、593kD和350kD3条蛋白带。Western-blotting试验证实:兔抗欧鳗Ig能识别欧鳗Ig的多种不同聚合体和Ig的重链,但不能识别Ig的轻链。结论:欧鳗Ig在自然条件下可能以四聚体和二聚体的形式存在,这与其它硬...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
冯建军 关瑞章 林鹏 郭松林
通过RT-PCR技术从欧鳗(Anguilla anguilla)脾脏总RNA中获得了编码成熟免疫球蛋白(Ig)重链的基因序列(GenBank accession No.GQ249838),该序列长1 686 bp,编码562个氨基酸残基,分子质量为62.2 ku。将该基因片段与pET-his载体连接构建原核表达载体,在大肠杆菌BL21中诱导表达,其表达产物经SDS-PAGE和Western-blotting分析表明新增的66 ku蛋白条带与预期值相符,且能够与兔抗欧鳗IgM血清发生强烈的特异性反应,证实了欧鳗免疫球蛋白重链(IgH)基因能够在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达;利用荧光定量PCR检...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
杨金先 陈强 林娟娟 朱春华 刘晓东 林天龙
应用杂交瘤单克隆抗体技术制备了8个分泌抗欧洲鳗(Anguilla anguilla)黏膜免疫球蛋白的单克隆抗体细胞株,并对这些单克隆抗体的特性进行了分析。结果显示,8株单抗中IgM有2株,IgG1和IgG2a各有3株;所有单抗均与欧洲鳗黏膜免疫球蛋白呈ELISA反应阳性,腹水抗体滴度为在104~106之间。进一步实验证实,这些单抗与供试的10种水产动物常见病原菌均无交叉反应;其中3株单抗与欧洲鳗血清IgM有不同程度的交叉反应;4株单抗与黏膜免疫球蛋白有交叉反应,其中2株单抗交叉反应较弱。以上结果提示,欧洲鳗黏膜免疫球蛋白和血清IgM之间既有各自独特的抗原决定簇,又有共同抗原位点,证实欧洲鳗黏膜...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
董传甫 林天龙 俞伏松 林能锋
以70%饱和硫酸铵盐析法制备鳗源创伤弧菌生物1型高致病菌株FJ03-X2的胞外产物(ECPs),攻毒试验表明,该ECPs对鳗鲡无致病力;SDS-PAGE分析表明,该ECPs由约36 ku为主的系列蛋白条带组成。制备ECPs的免疫刺激复合物(ISCOMs),以20μg/尾的剂量腹腔注射免疫规格为15~20 g/尾的欧洲鳗鲡,ELISA分析表明,21 d和28 d时的血清抗体效价约为1∶1 280,免疫印记显示,ECPs中分子量为36 ku以上的蛋白成份可被免疫欧洲鳗鲡血清所识别,是构成ECPs的主要免疫原;免疫保护试验表明,免疫欧洲鳗鲡显示出较高的免疫保护力。试验结果也显示出,单纯以ECPs等剂...
[期刊] 水产学报
[作者]
李文星 郑妨 凌露露 梁英 黄文树 聂品 黄贝
为研究鱼类信号与转录激活因子3 (signal transduction and activator of transcription 3,STAT3)在抗病毒免疫应答中的作用,实验利用逆转录PCR(RT-PCR)和RACE-PCR技术从日本鳗鲡中扩增获得了STAT3及其剪切异构体(AjSTAT3-L和AjSTAT3-S)。AjSTAT3-L及AjSTAT3-S开放阅读框全长分别为2 349和1 470 bp,编码782和489个氨基酸。基因结构分析结果显示,AjSTAT3-L具有23个外显子,AjSTAT3-S缺失了第2、3、4、5、6、7及21个外显子。AjSTAT3-L类似于哺乳动物STAT3,由N端结构域(NTD,1～120位氨基酸)、卷曲螺旋结构域(CCD,140～313位氨基酸)、DNA结合结构域(DBD,325～462位氨基酸)和SH2结构域(577～672位氨基酸)构成。相较于AjSTAT3-L,AjSTAT3-S缺失了整个CCD结构域,且NTD结构域也缺失了69个氨基酸。系统进化分析结果显示,AjSTAT3-L和AjSTAT3-S位于硬骨鱼类STAT3分支的基部。脊椎动物STAT3聚为一支,并与STAT1和STAT4聚为一大支。免疫荧光结果显示,AjSTAT3-L及AjSTAT3-S均定位于细胞质。此外,过表达AjSTAT3-L和AjSTAT3-S能显著抑制Poly I∶C诱导的IFN和Mx启动子的活化。研究表明,实验所克隆鉴定的日本鳗鲡STAT3及其剪切异构体,均能负调控鱼类抗病毒免疫应答。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
冯建军 关瑞章 郭松林
采用蛋白A亲和层析法分离纯化欧洲鳗鲡(Anguilla anguilla,欧鳗)血清免疫球蛋白(Ig),制备其特异性兔抗血清,并运用免疫组织化学技术研究了嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染的试验组鳗鲡和未经感染的对照组鳗鲡脾脏、肾脏和肝脏Ig阳性(Ig+)细胞定位与分布特点。结果表明:纯化后的Ig经SDS-PAGE检测含有分子质量约68 ku重链和26 ku轻链的2条清晰蛋白条带,由其制备的兔抗Ig血清效价达1∶51 200。对照组欧鳗脾脏Ig+细胞数较少,肾脏相对较多,肝脏未发现。试验组欧鳗脾脏Ig+细胞数量明显比对照组增多,肾脏中有所增多但不明显,肝脏中未发现。在...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
郭松林 冯建军 熊静 关瑞章
采用从鳗鲡分离的嗜水气单胞菌进行人工感染试验,以探讨感染后不同时期嗜水气单胞菌在欧洲鳗鲡肝脏、肾脏和肠道内的定位和由此引起的组织病理学变化。将细菌分2次对鳗鲡进行肌肉注射。第1次采用每克体质量103~107cfu的不同剂量注射以确定该菌的半数致死量,结果表明其半数致死量为5×104cfu/g。第2次以每尾鱼1×107cfu的剂量注射欧洲鳗鲡,此后分别在注射后6、24、48 h采集鳗鲡的肝脏、肾脏、肠道进行组织病理学和免疫组织化学定位研究。结果表明:3个时期的临床症状和病理变化存在一定的差别,鳗鲡早期无明显病理变化,而后期主要表现为败血症症状;鳗鲡肾脏组织的病理变化较其他脏器明显,主要表现为肾小...
[期刊] 水产学报
[作者]
林天龙 陈强 龚晖 刘晓东 俞伏松 杨金先 董传甫
应用杂交瘤单克隆抗体技术制备了 13个分泌抗欧洲鳗免疫球蛋白的单克隆抗体细胞株 ,并对这些单克隆抗体的特性进行了分析。经抗体级份和亚级份测定 ,其中IgM有 3株 ,IgG1有 5株 ,IgG2a有 3株 ,IgG2b有 2株 ;所有的单克隆抗体与欧鳗免疫球蛋白均有ELISA反应特性 ,抗体滴度 10 4～ 10 7,有七株单抗具有WESTERNBLOT反应特性 ,能在变性条件下识别欧鳗免疫球蛋白的重链。进一步实验证实这些单抗能特异地识别欧洲鳗、日本鳗的免疫球蛋白 ,而与鲫、淡水白鲳、罗非鱼、胡子鲶、美洲斑点叉尾血清免疫球蛋白以及水产动物常见病原菌如气单胞菌、爱德华氏菌、弧菌、柱状屈桡杆菌、...
关键词：
欧洲鳗鲡 单克隆抗体 免疫球蛋白
[期刊] 水产学报
[作者]
朱炳林 李俊 方维焕 李肖梁
MyD88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)是多数TLRs(Toll like receptor,TLRs)信号转导过程中的关键接头分子。研究根据MyD88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)TIR结构域(Toll-like/IL-1 receptor domain)保守区设计简并引物,通过PCR扩增,成功地从中华鳖脾脏cDNA中扩增出351bp的目标序列。测序后经结构域和序列比较分析,扩增片段为中华鳖的MyD88 TIR结构域。该序列与大黄鱼、鸡等脊椎动物的MyD88的TIR结构域序列同源性和相似性...
[期刊] 浙江农林大学学报
[作者]
郝燕敏 陈柯俐 冯丽君 李菲菲 崔敏龙 朴春兰
【目的】花器官发育是影响花观赏价值的重要因素，AP1类基因调控植物花器官的形成。研究菊科Asteraceae欧洲千里光Senecio vulgaris的SvAP1基因在花器官形成中的重要作用，旨在探究菊科复杂花序结构产生的调控机制。【方法】以欧洲千里光为材料克隆获得了SvAP1基因，通过多序列比对、构建系统进化树、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)反应、构建超表达载体、组织学染色观察等方法与技术，对SvAP1基因进行功能预测与分析。【结果】SvAP1基因开放阅读框长度为705 bp，编码234个氨基酸。多序列比对与系统进化分析显示：SvAP1基因属于MADS-box基因AP1类亚家族，C末端具有paleoAP1保守基序(motif)。欧洲千里光组织特异性表达分析表明：SvAP1基因在营养器官和花序中都有表达。转基因龙葵Solanum nigrum的形态学观察和石蜡切片技术分析显示：与野生型龙葵相比，转基因龙葵雌蕊发育异常，表现为子房膨大且雌蕊状组织增多。【结论】欧洲千里光SvAP1基因在龙葵中的超表达影响雌蕊发育，与ABC模型中A类基因超表达对植物花器官发育造成的影响存在差异，即转基因龙葵雄蕊无明显变化且雌蕊未转变为萼片状或叶片状器官。这可能与欧洲千里光花器官调节机制和花序结构的复杂性有关。由此可知，欧洲千里光SvAP1基因可能作为花器官特征基因在花器官形成中具有重要作用。图6表1参35
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