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[期刊] 中国农业科学
[作者]
张建成 杜俊杰 刘和 王鹏飞 薛晓芳 穆霄鹏 陈俊奇
【目的】克隆、分析欧李[Cerasus humilis(Bge)Sok]八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase,PSY)基因,并利用大肠杆菌异源表达体系验证其功能。【方法】以欧李果实中分离的总RNA为模板,通过RT-PCR扩增到PSY cDNA中间片段,再利用RACE技术获得该基因cDNA全长并分析其序列;然后利用PCR技术获得欧李PSY cDNA编码区全长,将其克隆到原核表达载体pET-28a(+),获得重组质粒pET-ChPSY,转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达,并利用工程菌株验证融合蛋白6×His-PSY的催化活性。【结果】欧李PSY cDNA全长1 559 bp,...
关键词：
欧李 八氢番茄红素合成酶 克隆 功能表达
[期刊] 林业科学
[作者]
郑阳霞 季静 王罡 杨婉身
A novel 1.3 kb cDNA was amplified from cDNA library of Lycium barbarum by PCR.This cDNA clone was further inserted into pGEM-T. The sequence analysis showed that the cDNA was 1 292 bp long with an open reading frame of 1 275 bp, and encoded a polypeptide of 425 animo acids. Its cDNA sequence showed ...
关键词：
宁夏枸杞 八氢番茄红素合成酶基因 克隆
[期刊] 中国农业科学
[作者]
古英洪 汤浩茹 张义正
【目的】克隆桃(Prunus persica)多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(polygalacturonase-inhibiting protein,PGIP)基因,并进行原核表达研究。【方法】根据李属植物pgip保守区域设计1对特异引物,以桃叶片总RNA为模板,通过RT-PCR获得了约1kb的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定,并对该序列进行分析。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建融合表达质粒,转化到Escherichia coli Rosetta-gami(DE3)pLysS中进行表达。【结果】测序结果显示,桃多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白cDNA编码区...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
张建成 陶能国 仝铸 邓秀新
【目的】克隆、分析‘红肉脐橙’(Citrus sinensis Osbeckcv.Cara Cara)八氢番茄红素合成酶(phytoenesynthase,PSY)基因,并进行原核表达。【方法】以‘红肉脐橙’果实中分离的mRNA为模板,通过RT-PCR扩增到PSY cDNA片段,并分析其序列;利用PCR技术获得‘红肉脐橙’PSY cDNA的编码区全长,并将其克隆到原核表达载体pET28a(+),获得重组质粒pET-CitPSY转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达。【结果】‘红肉脐橙’PSY cDNA长1520bp,最大开放读码框为1308bp,可编码436个氨基酸,核酸序列及其推导的氨基酸...
关键词：
红肉脐橙 八氢番茄红素合成酶 原核表达
[期刊] 中国农业科学
[作者]
朱海生 李永平 温庆放
【目的】分离和克隆草莓果实八氢番茄红素合成酶基因psy,分析其序列特征,了解其在不同组织部位的表达情况。【方法】采用RT-PCR和RACE技术从草莓果实中克隆草莓类胡萝卜素合成途径中关键基因psy,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定氨基酸序列进行分析,并用半定量PCR法研究psy基因在不同组织中的表达。【结果】分离到psy基因,GenBank登录号为FJ784889。该cDNA全长1 458 bp,具有1个1 194 bp的完整开放阅读框(ORF),编码398个氨基酸。序列分析表明,psy编码的氨基酸序列与其它植物的PSY蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,草莓PSY与胡萝卜和玉米...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
白俊杰 叶星 李新辉 简清 罗建仁
用逆转录 聚合酶链式反应 (RT PCR)方法 ,从猪脑垂体总RNA中扩增出编码猪生长激素 (GH)成熟肽基因序列 ,定向克隆至质粒pUC18。序列分析表明 ,克隆的猪GHcDNA长 5 73bp ,不含信号肽序列 ,并在该序列之前加入一起始密码子ATG。将猪GHcDNA定向克隆至原核表达载体pBV2 2 0 ,构建成重组猪GH基因表达载体pBVpGH7。SDS PAGE和薄层扫描分析表明 :经 42℃诱导 ,pBVpGH7在大肠杆菌中可表达一分子量约 2 2 0 0 0的特异蛋白 ,表达量约占细胞总蛋白的 2 0 .5 %。
[期刊] 华北农学报
[作者]
徐欢 冯湘沅 郑科 杨琦 段盛文 成莉凤
为了获得高酶活力的苎麻脱胶果胶裂解酶，为后续分子改造和新型苎麻生物脱胶酶制剂复配提供理论依据。将果胶裂解酶基因pel419从重组质粒pEASY-Blunt E1-pel419更换至pET28a载体中，转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达；用SDS-PAGE和Western Blot检验pel419基因的表达效果；用生物信息学软件分析Pel419理化表征和系统发育，预测其二级结构、高级结构及关键氨基酸位点。结果表明，工程菌pET28a-pel419/BL21的果胶裂解酶活力为434.4 U/mL,较pEASY-Blunt E1-pel419/BL21提高了1.7倍；Pel419含375个氨基酸，N末端前22个氨基酸为信号肽，理论pI值为6.59,有4个半胱氨酸，不稳定系数为18.20;其蛋白结构域含有典型的右手β-螺旋结构，属于Pec lyase C家族；Pel419的Ca~(2+)结合位点为ASP151、ASP153和ASP192,定位发现3个保守位点均暴露在三维空间的表面，并处于底物结合空间口袋。大幅度提高了Pel419表达量，并获得了Pel419关键结构信息。
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
刘冬雨 陶贤继 魏华
通过RACE-PCR首次克隆获得了普通小球藻(Chlorella vulgaris)中八氢番茄红素合成酶编码基因psy的cDNA全长序列。该序列全长1 605 bp,包括1 245 bp开放阅读框,编码415个氨基酸。氨基酸序列对比及系统发生分析表明其与其他物种的PSY蛋白具有同源性,与绿藻聚为一支,与小球藻(Chlorella variabilis)、原壳小球藻(Auxenochlorella protothecoides)和佐夫色绿藻(Chromochloris zofingiensis)的遗传距离最
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
闻雅男 王学英 夏润玺 王媛媛
为获得大量、高活性植酸酶以及研究和开发新型微生物生物制剂,从自行筛选的黑曲霉中提取RNA,通过反转录合成模板cDNA,根据phyA成熟肽编码序列设计出一对引物,PCR扩增phyA,对扩增片段进行了克隆,通过限制性内切酶酶切分析、DNA测序证明phyA基因克隆成功。从pBS-T-phyA克隆中获取phyA编码序列,将其与pET28a+质粒连接,构建pET28a+-phyA重组质粒,并在大肠杆菌中获得高效表达。本研究成功克隆phyA,该基因全长1404bp,以ATG为起始密码子,TGA为终止密码子,编码467个氨基酸组成的多肽。SDS-PAGE电泳结果表明,phyA在大肠杆菌中成功表达,成熟植酸酶...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
林艺远 刘国平 吴斌 赵战勤 陈焕春
以湖北本地分离的致猪水肿病大肠杆菌鄂E株为模板,PCR扩增去掉信号肽和跨膜区的SLT-IIeB基因,将其克隆到原核表达载体pGEX-KG。同时对筛选出的阳性质粒pGEX-SLT-IIeB进行测序,测序结果与Genbank上发表的12个SLT-IIeB基因序列的同源性达100%,表明该基因保守性很好。重组质粒pGEX-SLT-IIeB经IPTG诱导后在大肠杆菌中实现了表达,SDS-PAGE分析表明表达产物GST-SLT-IIeB有特异性表达带,Western-blot检测证实表达产物具有免疫反应性。
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
陈晓月 金宁一 邹伟 海洋 马海利 李昌
根据GenBank中枯草芽孢杆菌的P43启动子基因序列,设计合成了一对引物,用PCR方法钓取枯草芽孢杆菌AS.1655菌株的启动子基因,PCR产物经琼脂糖凝胶回收纯化后,连接到pMD18T-simple载体上,进行序列测定。测序结果表明:枯草芽孢杆菌AS.1655菌株的启动子全长427 bp,由两个叠加的启动元件组成,分别为5σ5和3σ7 RNA聚合酶识别的位点,与GenBank中的其他序列比较发现核苷酸的同源性为99.5%,氨基酸的同源性为98.6%,说明枯草杆菌P43启动子的基因序列高度保守。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
王慈 曹敏杰 郑晓江 詹春兰 刘光明 蔡秋凤
以鲢(Hypophthalmichthys molitrix)肌肉cDNA为模板,利用小清蛋白特异性引物进行PCR扩增,克隆得到β小清蛋白两种不同亚型,即Ⅰ型、Ⅱ型编码区基因。将目的基因片段连接到pET28a(+)表达载体,并在大肠杆菌[E.coli BL21(DE3)]中诱导表达。结果表明,经诱导的小清蛋白重组质粒菌株有特异的蛋白表达。SDS-PAGE分析显示,目的蛋白的分子量约为13 kD,与预期大小一致。菌体超声破碎后发现2种亚型的小清蛋白均为可溶表达。利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,得到高纯度的重组小清蛋白PVⅠ和PVⅡ。经Western Blot鉴定,重组小清蛋白PVⅠ和P...
关键词：
鲢 小清蛋白 cDNA克隆 原核表达
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
熊帅 张军科 谌悦
【目的】从富士苹果幼果果实中克隆多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)基因,并进行原核表达,为进一步研究PGIP的生物学功能奠定基础。【方法】根据Genbank中已经发表的苹果PGIP基因序列设计引物,采用RT-PCR从苹果果实中扩增PGIP基因cDNA,回收目的基因片段并连接到pMD18-T载体,鉴定后进行测序。然后将PGIP全长cDNA和去信号肽的cDNA导入到pET-32a(+)表达载体中,分别获得融合表达质粒pET-PGIP和pET-PGIP-X,将其分别转化大肠杆菌BL21感受态细胞,用不同终浓度IPTG进行诱导表达,收集表达产物并进行SDS-PAGE电泳。对pET-PGIP-X基因工...
[期刊] 草业科学
[作者]
马春娟 杨宇泽 邹爱爱 孙康永杰 万雪瑞 王川 魏亚琴
为提高纤维素的降解效率、构建高效表达的纤维素酶基因工程菌，本研究以牛瘤胃液微生物全基因组为模板，首先通过PCR扩增内切葡聚糖酶eg基因，然后与pET-28a连接获得表达载体pET-28a::eg并转化至大肠杆菌(Escherichia coli)菌株BL21(DE3)中，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达EG蛋白，最后用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定重组内切酶的酶活力，分析其酶学性质。结果表明：成功构建表达载体pET-28a::eg，重组菌株E. coli BL21/pET-28a::eg在28℃用IPTG诱导14 h后纯化得到重组的EG蛋白，EG蛋白大小约为50 kDa，刚果红染色有明显水解圈。用DNS法测得EG的酶活为12.60 U·mL~(-1)，滤纸总酶活为3.53 U·mL~(-1)。重组酶在不同底物的反应中，羧甲基纤维素钠为底物的酶活力最高，脱脂棉最低。重组酶的最适温度为40℃，最适pH为7.0。在此条件下，Ca~(2+)、Mg~(2+)、Fe~(2+)、K~+、Mn~(2+)等离子均可对重组蛋白EG的酶活力具有促进作用，Zn~(2+)可促进但差异不显著，而Hg~(2+)、Cu~(2+)对EG的酶活力具有抑制作用。本研究构建的重组内切酶菌株可以高效水解纤维素，为内切酶的工业应用奠定了基础。
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