【背景】流感病毒的抗原性主要是由病毒的表面糖蛋白HA决定的，前期利用欧亚类禽型H1N1猪流感病毒（EA H1N1 SIV）HA蛋白单克隆抗体（mAb）筛选抗原逃逸株发现，HA蛋白190、230和269位（H3编码）氨基酸的改变能够导致病毒发生抗原逃逸，并发现在新近分离的EA H1N1 SIV HA蛋白广泛存在这3个氨基酸的变异。【目的】进一步探索哪些氨基酸对病毒的抗原性具有关键作用，为流感的防控提供科学依据。【方法】选取一株病毒A/swine/Liaoning/SY72/2018(H1N1) SY72为模式病毒，建立该病毒的反向遗传系统（RGS），又以SY72为骨架，拯救含有HA基因190、230和269单点突变重组病毒；利用rSY72病毒制备灭活疫苗，分别免疫SPF鸡和非免疫猪制备其相应的血清，通过中和试验和血凝抑制（HI）试验分析病毒的抗原性，确定影响病毒抗原性的关键氨基酸位点；继而评估HA蛋白不同位点氨基酸的改变对病毒复制特性及受体结合特性等的影响。【结果】分析SY72病毒的HA氨基酸序列发现，该病毒HA蛋白分别含有190D、230M和269R。利用反向遗传技术，分别拯救了病毒rSY72及单点突变病毒rSY72HA/D190N、rSY72HA/M230I和rSY72HA/R269M；中和试验结果表明，与rSY72相比较，3株突变病毒均能够与两株mAbs发生一定反应；HI试验结果显示，与rSY72相比较，突变病毒rSY72HA/D190N与rSY72免疫鸡血清和猪血清的反应减弱，HI抗体效价分别出现了4倍和8倍的差异，而病毒rSY72HA/M230I和rSY72HA/R269M与两种血清的反应差异不明显，表明HA蛋白190位氨基酸改变对病毒的抗原性影响最为明显；病毒蚀斑测定及复制动力学研究结果发现D190N的氨基酸替换导致病毒rSY72HA/D190N在MDCK细胞上形成的蚀斑减小，而R269M的氨基酸替换导致病毒rSY72HA/R269M在MDCK细胞上的复制能力下降；3个位点的氨基酸替换均未影响病毒的受体结合特性。【结论】HA蛋白190位氨基酸对EA H1N1 SIV抗原性具有决定作用，269位氨基酸突变使得病毒在MDCK细胞上的复制能力降低。这提示在后续开展的病原学监测中要密切关注这些氨基酸的变异情况，提高对动物流感的预警预报。

【目的】表达欧亚类禽型(eurasian avian-like,EA)H1N1猪流感病毒(SIV)的血凝素(HA)蛋白,并对其免疫原性进行测定。【方法】利用RT-PCR技术扩增病毒A/swine/Zhejiang/245/2013(H1N1)(ZJ245)的HA基因,将其克隆至真核表达载体pCAGGS中,获得重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245),将其转染293T细胞,采用间接免疫荧光(IFA)检测和Western blot检测HA蛋白在体外的表达;将重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)经肌肉注射途径、以100μg/只剂量免疫16只6周龄BALB/c小鼠(I组和II组),间隔3周后进行加强免疫(二免);同等数量的小鼠以相同方式注射100μL无菌PBS作为非免疫对照组(III组和IV组)。首免和二免每周采血,分别采用血凝抑制(HI)试验和病毒中和(VN)试验两种方法测定不同类型的血清抗体效价;二免2周后,其中两组小鼠(I组和III组)用50μL(106.0EID50)的ZJ245病毒经滴鼻感染途径进行攻毒,另外两组(II组和IV组)用A/swine/Heilongjiang/44/2009(H1N1)(HLJ44)病毒进行攻毒。攻毒后14 d内每天观察小鼠的临床症状、统计发病与死亡情况,且每天称量小鼠体重,在体重下降比率超过25%时判定为小鼠死亡。攻毒后第3天,每组随机剖杀3只小鼠,分别采集脑、鼻甲、肺、脾和肾等脏器,匀浆处理后通过接种10日龄的非免疫鸡胚测定脏器的病毒含量。通过小鼠体重变化以及脏器滴定的病毒含量评估重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)的免疫保护效果。【结果】经酶切鉴定和测序验证表明ZJ245的HA基因的已正确克隆至真核表达质粒p CAGGS中获得重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245),经体外转染293T细胞后,IFA和Western blot证实了病毒的HA蛋白能够正确表达,并具有良好的生物学活性;小鼠的免疫与攻毒试验结果表明,重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)首免后一周可检测到针对同源病毒ZJ245的低水平HI和VN抗体,加强免疫后抗体水平明显升高,HI抗体达到76.88、VN抗体达到152.5;同时针对异源病毒HLJ44也产生了较低水平的HI和VN抗体。106.0 EID50的同源病毒ZJ245攻毒时,与非免疫组小鼠相对比,重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)的免疫完全阻止了因病毒攻击而导致的小鼠体重下降以及肺脏和鼻甲内病毒的复制;106.0 EID50的异源病毒HLJ44攻毒时,相比非免疫组小鼠,质粒免疫组小鼠体重的下降比率、以及肺脏和鼻甲内的病毒滴度均显著降低(P<0.05)。【结论】重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)能够有效表达病毒HA蛋白,免疫后可使小鼠获得完全抵抗ZJ245感染及部分抵御HLJ44感染的免疫保护力,表明重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)具有良好的免疫原性。

【目的】了解近年来中国H9N2亚型禽流感病毒毒力变化和抗原性变异的特点,【方法】对分离于1998—2008年间的25株H9N2亚型禽流感病毒分离株进行了EID50、ELD50、MDT、ICPI、IVPI和8周龄SPF鸡人工感染排毒试验,测定了部分分离株与抗H9N2亚型禽流感病毒Hp参考株HA蛋白单抗2A4和F6的血凝抑制(HI)和中和反应特性,对具有不同反应特性分离株的HA基因进行了序列分析。【结果】不同分离株呈现致病力差异,具多态性特征,3#、12#和14#分离株致病力偏强,能引起部分SPF鸡发病和死亡,人工感染8周龄SPF鸡排毒时间更早,排毒期更长。3#和12#分离株与单抗2A4和F6呈现...

【目的】流感病毒的致病性是由多个基因共同决定的，笔者之前的研究结果发现当两株具有相似基因特征的H1N1亚型猪流感病毒进行HA基因替换以后，病毒对小鼠的致病性发生了改变。通过确定影响病毒致病性的关键氨基酸位点，为进一步揭示流感病毒致病力差异奠定了基础。【方法】对ZD71和SY130的HA蛋白氨基酸序列进行比对，确认氨基酸差异位点并设计定点突变引物，构建单点突变的重组病毒并测定其鸡胚半数感染量（EID50）。将拯救的亲本病毒、HA单基因替换重组病毒及单点突变重组病毒以感染复数（MOI）为0.001和0.1的病毒量分别接种于MDCK和A549细胞，测定病毒的体外复制能力；将上述各株病毒以50μL含106EID50的剂量经滴鼻途径接种BALB/c小鼠，分别采集小鼠的脑、鼻甲、肺、脾、肾等脏器，匀浆处理后接种鸡胚分析病毒在小鼠体内各脏器的复制情况；将病毒分别以50μL含101-106 EID50的剂量经鼻腔感染BALB/c小鼠，感染后每天称量小鼠体重，当小鼠体重下降比率超过25%时判定为死亡，统计死亡情况，测定病毒的小鼠半数致死量（MLD50），评估各突变病毒对小鼠的致病性，与亲本病毒进行分析比较后，获知决定病毒致病性的关键氨基酸位点。【结果】ZD71和SY130病毒HA蛋白共存在4个氨基酸差异位点，分别为4、138、144和225位（H3 Numbering）。经过定点突变、病毒拯救及序列测定确认，分别获得含有单个位点突变的重组病毒。通过测定病毒在MDCK和A549细胞上的复制情况，结果发现与亲本病毒rZD71相比较，突变病毒rZD71-HA/G225E在感染MDCK细胞的各检测时间点、及感染A549细胞24—48 h后，复制滴度均显著提高；与rSY130相比较，突变病毒rSY130-HA/E225G在感染MDCK细胞12—36 h后、及感染A549细胞36—72 h后，复制滴度均显著降低。而4、138、144位点的突变对病毒的复制影响较小。进一步的小鼠感染试验发现HA 225位氨基酸的改变显著影响了病毒对小鼠的致病性，与亲本病毒rZD71相比，225位氨基酸由G突变为E后，病毒rZD71-HA/G225E的MLD50由4.32 log10EID50降低至3.0 log10EID50；病毒不仅在小鼠鼻甲和肺脏内检测到，而且在脾脏和肾脏中也均有一定水平的复制。【结论】HA蛋白225位氨基酸对两株H1N1 SIV对小鼠的致病性具有重要决定作用，提示在后续开展的病原学监测中要密切关注该位点氨基酸的变异情况，为更好地防控动物流感乃至人流感的大流行提供科学依据。

【目的】了解猪流感病毒的分子流行病学,为动物流感的防控提供科学依据。【方法】将猪的鼻拭子接种鸡胚进行病毒分离,对血凝试验阳性的样品在SPF鸡胚上进一步纯化、增殖,采用RT-PCR对分离毒株的全基因组进行扩增,使用Applied Biosystems 3500x L Genetic Analyzer进行序列测定,利用DNASTAR软件对测序基因片段进行整个阅读框的核苷酸序列同源性比对分析,并用MEGA 6.0绘制遗传进化树及分析氨基酸位点。【结果】分离毒株A/swine/Zhejiang/245/2013(SW/ZJ/245/13)为H1N1亚型病毒,核苷酸的分析结果发现该分离毒株的8个基因片段...

根据GeneBank中流感病毒H1N1亚型M基因和NS基因序列,分别设计扩增M基因和NS基因的特异性引物,采用RT-PCR方法扩增猪流感病毒天津株M基因和NS基因,分别将RT-PCR产物克隆至pMD18-T载体,进行序列测定和分析。结果显示M基因全长1027 bp,其核苷酸序列与参考毒株间的同源性在85.8%~99.7%,NS基因全长890 bp,与参考毒株之间的核苷酸序列同源性在80.7%~99.2%。M和NS基因的系统发育树显示:TJ2、TJ4株与我国香港、上海和广东H1N1亚型猪流感病毒属同一分支,但与上海、广东分离株的亲缘关系更近;与2009年全球流行的人甲型H1N1流感病毒变异株和部...

用SPF鸡胚从2005-2006年采集自天津地区猪群样品中分离出3株猪流感病毒,测定了分离病毒的部分理化特性和生物学特性。3个猪流感病毒分离株均能凝集1%鸡红血球,将其制成琼脂扩散抗原与猪流感标准阳性血清反应均出现清晰白色沉淀线;经中国动物卫生与流行病学中心系统鉴定,3个毒株均为H1N1亚型,分别命名为A/Swine/Tianjin/TJ2/2005(H1N1)、A/Swine/Tianjin/TJ3/2005(H1N1)、A/Swine/Tianjin/TJ4/2006(H1N1)株。这3株病毒都为热不稳定型,60℃作用10 min即可使病毒失去感染能力,病毒对酸性环境(pH3.0)和乙醚均...

【目的】对H9N2亚型猪流感病毒NS1(nonstructural protein1)基因进行原核表达,获得纯化表达产物,以期为检测猪流感抗体的ELISA试剂盒的研制奠定基础。【方法】采用RT-PCR扩增了猪流感病毒(H9N2)的NS1基因,将其克隆于表达载体pET-28a(+)上构建成重组质粒pET-NS1,转化受体菌E.coliBL21-DE3感受态细胞,经酶切鉴定及序列分析,筛选出正确重组质粒转化子。【结果】经终浓度5mmol·L-1乳糖诱导,SDS-PAGE电泳结果显示,重组蛋白NS1得到大量表达,分子质量约为26kD。经Western-blotting分析,表达蛋白能与阳性血清发生特...

【目的】监测陕西省猪流感的流行与传播情况,为猪流感研究提供参考。【方法】从生猪养殖场和屠宰场表观健康猪中随机采取猪鼻/气管拭子样本,经SPF鸡胚分离,对HA阳性样本进行猪流感病毒RT-PCR鉴定。测定分离株全基因序列,通过MEGA4构建基因进化树,并进行遗传变异分析。【结果】从500份样本中分离鉴定出6株H1N1流感病毒,病毒分离率为1.2%。获得6个核苷酸相似性为98.3%—99.1%的分离株全基因序列。遗传进化分析表明6个分离株都位于avain-like H1N1猪流感病毒谱系,与中国江苏,辽宁,山东和香港等地H1N1猪流感病毒株同源性达97%—99%。6个分离株的8个基因片段均在蛋白受体...

【背景】H6亚型禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）广泛流行于我国南方地区，是我国家禽中最常见AIV之一。H6N1亚型AIV频繁地与其他野鸟源毒株重配，并且可以作为供体为高致病性AIV提供内部基因片段，产生新型重组病毒，进而威胁人类健康。【目的】通过对我国H6N1亚型AIV的演化动态及其相关生物学特性分析研究，为我国禽流感的综合防控提供数据支持。【方法】采集2019—2022年我国25个省（直辖市、自治区）的活禽交易市场及养殖场家禽喉和泄殖腔拭子，通过接种鸡胚分离到7株H6N1亚型AIVs并对其进行全基因组测序，分析其遗传演化特征、受体结合特性及其对SPF鸡和BALB/c小鼠的感染性。【结果】遗传演化分析表明，7株病毒的基因与分离于北美及东南亚地区的野鸟源病毒基因同源性较高，基因来源复杂，具有明显的遗传多样性。贝叶斯演化分析表明，H6亚型AIV HA基因曾发生过多次的跨洲际传播，欧亚谱系病毒在北美地区也有着较长时间流行。1株病毒HA基因与北美地区毒株基因高度同源，根据贝叶斯演化分析结果，推测该病毒在野鸟体内经历了复杂的基因重配后形成，后经野鸟传入我国。特殊氨基酸位点分析结果显示，病毒HA蛋白裂解位点序列均为PQIETR↓GLF，符合低致病性AIV特征；此外，另有1株病毒的NP蛋白发生Y52H突变，据报道，该突变对AIV获得抵抗人干扰素刺激基因BTN3A3的能力起到关键作用。受体结合特性分析表明，部分毒株具有双受体结合特性，但结合人源受体能力弱于结合禽源受体能力。病毒对SPF鸡的感染性试验表明，鸡感染A/chicken/Jiangxi/S40445/2019(H6N1)后能通过呼吸道及消化道排毒，并且病毒可在鸡群内通过接触传播。鸡感染A/duck/Jiangxi/S10941/2019(H6N1)后仅有少数鸡通过呼吸道排毒，病毒无法在鸡群间通过接触传播。BALB/c小鼠的感染性试验表明，H6N1亚型AIV无需提前适应便可在小鼠呼吸道内有效复制，但对小鼠仍呈低致病力。【结论】2019—2022年分离于我国的H6N1亚型AIV基因大部分来源于野鸟源病毒，候鸟可经东亚-澳大利亚迁徙路线将病毒传入我国；部分病毒能够结合人源唾液酸受体并在小鼠呼吸道内有效复制，表明该亚型病毒对公共卫生安全构成潜在威胁。

为研究硫酸酯化酵母β-葡聚糖对流感病毒血凝抑制作用及对mRNA转录的影响,以猪流感病毒A/tianjin/1/TJ2(H1N1)感染MDCK细胞为模型,采用血凝抑制试验(HI)及SYBR Green Real-time PCR方法,探索硫酸酯化酵母β-葡聚糖对流感病毒血凝抑制作用及其对mRNA转录影响。结果显示,硫酸酯化酵母β-葡聚糖在浓度超过1.25 mg/m L时,能对猪流感病毒血凝产生抑制作用,且在5 mg/m L时对猪流感病毒mRNA转录具有抑制作用。因此,硫酸酯化酵母β-葡聚糖具有抑制流感病毒在MDCK细胞复制的作用,其作用机制可能与抑制流感病毒HA靶点及影响mRNA转录有关。

【目的】建立H1N1亚型猪流感病毒反向遗传学操作系统及拯救出能够在动物传代细胞中高水平复制的H1N1亚型猪流感疫苗株。【方法】利用反向遗传操作技术,对猪流感病毒广东分离株进行拯救。【结果】首次成功拯救出全部片段均来自于亲本株的猪流感病毒rH1N1,并且成功拯救出了具有高度细胞适应性毒株re-LM株,研究结果表明二者均具有良好的遗传稳定性。rH1N1经MDCK细胞连续传代培养后,血凝价最高仅为1:64;而re-LM的血凝价最高可以稳定在1:1024,表明该毒株具有细胞繁殖高产的特性。用该重组病毒制备油乳剂灭活苗免疫2月龄仔猪,首免2周即可检测出HI抗体,平均效价在1:32以上,三免后2周HI抗体...

【目的】研究H3N2和H1N1甲型流感病毒感染对仔猪肺脏CDK9基因表达的影响,揭示流感发病机制与CDK9基因的相关性。【方法】以接种PBS的仔猪为空白对照,利用实时荧光定量PCR技术和半定量免疫组织化学法,检测H3N2和H1N1甲型流感病毒接种感染7d后,仔猪肺脏CDK9的mRNA和蛋白表达的变化,并在电子显微镜下观察CDK9阳性细胞的定位。【结果】实时荧光定量PCR检测表明,H3N2和H1N1甲型流感病毒感染仔猪7d后,肺脏组织内CDK9基因mRNA的相对表达量分别为0.42和0.36,与对照(1.0)相比显著降低(P<0.05)。半定量免疫组织化学检测结果显示,仔猪受到H3N2和H1N1...

为了解湖北鸡源禽流感病毒的遗传进化和氨基酸变异情况,将分离到的2株禽流感病毒进行全基因组测序及遗传进化分析。利用RT-PCR扩增流感病毒基因组片段,PCR扩增流感病毒片段、克隆至pMD18-T载体,并对序列特征进行生物信息学分析。结果表明:分离到的2株病毒高度同源,其HA和NA基因属于Y280谱系,PB1、PA、NP和NS基因属于SHF98-like谱系,PB2和M基因属于G1-like谱系;HA裂解位点均为-RSSR↓GLF-,具有低致病性流感病毒的分子特征;在HA蛋白上比当前流行株Y280多了一个潜在糖基化位点313(NCS);在234位点(对应H3编号中的226)产生了从Q到L的突变;在M2蛋白的31位点均产生了从S到N的突变。该2株H9N2亚型流感病毒为Y280谱系的病毒,这提示湖北地区可能也流行Y280-like分支禽流感病毒,虽然属于低致病性禽流感病毒(Low pathogenic AIV,LPAIV),但具有感染哺乳动物的潜在风险。

为了阐明新疆油鸡H9亚型流感病毒PB1基因的分子特征与进化趋势,本研究采用RT-PCR技术对新疆油鸡分离株A/Chicken/Xinjiang Baicheng/1/2014(H9 N2)的PB1基因进行了克隆、测序及分子进化分析,将PB1基因的核苷酸序列和对应的氨基酸序列与Genbank中已经公布的参考序列进行同源性比较。结果表明,新疆油鸡分离株的PB1基因由2274个碱基组成,编码757个氨基酸,与AIV A/chicken/Henan/89/2013(H7N9)的PB1基因处于同一分支,其核苷酸和氨