【目的】法尼基焦磷酸合酶（ｆａｒｎｅｓｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ，ｆｐｓ）是天然橡胶生物合成的甲羟戊酸途径中的关键酶，获得橡胶草ｆｐｓ基因并转化野生橡胶草，为研究ｆｐｓ基因在橡胶草橡胶生物合成过程中的调控作用奠定基础。【方法】采用同源克隆的方法获得橡胶草ｆｐｓ基因全长ｃ ｄｎａ序列，并对该基因进行生物信息学分析。对橡胶草和其他１８种不同高等植物的ｆｐｓ氨基酸序列进行多序列比对及进化树分析。提取橡胶草不同组织：根、叶柄、叶、花梗、花和种子ｒｎａ，对ｆｐｓ基因进行组织特异性表达分析，并对不同生长时期的橡胶草ｆｐｓ表达量进行比较，分析橡胶草生长过程中ｆｐｓ的调节作用。将该基因在野．．．

【目的】法尼基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophosphate synthase,FPPS)是单萜和倍半萜生物合成途径分支点的关键酶,获得芫菁法尼基焦磷酸合酶基因(FPPS)是探究其与斑蝥素生物合成途径关系的基础。论文旨在克隆锯角豆芫菁(Epicauta gorhami Marseul)FPPS,预测该基因及其编码蛋白的结构、性质与功能,并实现其编码蛋白的原核表达。【方法】首先根据已知昆虫FPPS编码蛋白的保守区序列,利用CODEHOP软件设计简并引物,利用RT-PCR获得锯角豆芫菁的cDNA模板,巢式PCR扩增锯角豆芫菁FPPS保守区;随后根据所得的保守区片段设计特异性引物,运用RA...

以洋常春藤叶片为材料，采用同源ＲＴ–ＰＣＲ方法，克隆获得了洋常春藤法呢基焦磷酸合成酶基因，其Ｃ ＤＮＡ序列大小为１ ０５０ ｂＰ，开放阅读框为１ ０２６ ｂＰ，推测编码３４２个氨基酸残基，该序列的核苷酸、氨基酸与五加科植物有同源性；用在线数据软件进行分析，推测该蛋白可能存在于细胞质之中，定位在细胞膜外，ＦＰＳ蛋白的相对分子质量为３９ ７３５．７；该蛋白含有２个天冬氨酸保守结构域，其二级结构主要以α螺旋和无规则卷曲为主；双子叶植物系统进化树分析结果表明，洋常春藤的ＦＰＳ与刺五加、人参、三七、西洋参、辽东楤木的ＦＰＳ亲缘关系最近，这一结果符合传统的分类法规则。

【目的】天然橡胶生物合成途径是典型的植物类异戊二烯代谢途径，MVA代谢途径是天然橡胶与萜类化合物所需的五碳构成单元IPP和DMAPP生物合成的主要途径之一。由2分子IPP和1分子DMAPP聚合形成的法尼基焦磷酸是乳管细胞天然橡胶生物合成的起始前体，厘清该起始物的合成酶酶学性质不仅有助于阐明天然橡胶生物合成机制，同时也为天然橡胶遗传改良提供酶学理论基础。【方法】对橡胶树热研7-33-97基因组中同源的3个预测的法尼基焦磷酸合成酶(HbFPS1、HbFPS2、 HbFPS3)进行序列特征分析，优选胶乳中高表达的2个法尼基焦磷酸合成酶基因构建原核表达载体，经蛋白纯化与MALDI TOF质谱确证，并同时进行体外酶活性检测，最终评价其对体外橡胶合成效率的影响。【结果】橡胶树基因组含有的3个预测的法尼基焦磷酸合成酶都含有特征性的2个保守结构域“DDIMD”和“DDYXD”及相似的三维空间结构，其中胶乳高表达的HbFPS1和HbFPS2基因编码的蛋白氨基酸序列相似性达到95%,说明HbFPS1和HbFPS2 2个冗余基因可能经历了基因组中同源基因的后期拷贝事件。同时HbFPS1和HbFPS2基因能够正确地在大肠杆菌中表达，HbFPS3却难以正确折叠而形成包涵体，体现了这2类蛋白质N末端氨基酸明显的亲疏水性差异对蛋白可溶表达的影响。HbFPS1和HbFPS2蛋白在体外除了能够利用GPP为底物合成FPP外，还能够直接转化IPP和DMAPP生成FPP。同时，分别添加HbFPS1和HbFPS2蛋白能够提高体外橡胶合成效率并且存在蛋白剂量相关性特征。与对照相比，在特定的反应体系中，当HbFPS1和HbFPS2蛋白添加量增加时体外橡胶合成效率随之不同程度地提高，且在100μg时促进作用最明显。【结论】橡胶树胶乳中高表达的2个冗余基因HbFPS1和HbFPS2与HbFPS3基因编码蛋白的序列差异可能影响酶的活性。HbFPS1和HbFPS2蛋白确证是胶乳中能够促进天然橡胶合成的功能酶，而且能够直接聚合IPP和DMAPP生成天然橡胶合成起始物FPP。本研究建立了基于天然橡胶粒子的体外蛋白功能研究平台，并证明HbFPS1和HbFPS2酶在一定的含量下能够显著地提升橡胶合成效率。通过调控HbFPS1和HbFPS2酶活性将有助于橡胶树优质高产品种的改良与选育。

ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)催化ADP-葡萄糖合成反应,是淀粉生物合成的限速酶之一。从高淀粉甘薯品种川薯34总RNA逆转录的cDNA中克隆了AGPa1和AGPa2两个α亚基编码序列,进行生物信息学分析后,插入植物高效表达载体pCamb ia1301构建了pC-AGPa1和pC-AGPa2两个双元表达载体,并导入根癌农杆菌EHA105中。获得的工程菌菌株可用于遗传转化甘薯、马铃薯和木薯等重要的薯类作物,为薯类作物高淀粉育种奠定了基础。

以高产脂思茅松为材料,基于转录组数据分析,采用RT-PCR方法获得思茅松牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPS)基因的c DNA序列,Gen Bank登录号为KM382173.1.序列分析显示,思茅松GGPS基因c DNA全长1 152 bp,编码383个氨基酸,属于GGPS家族.序列比对分析显示,思茅松GGPS拥有GGPS家族特有的两个功能保守结构域FARM(DDLPSMDND)、SARM(DDILD),其与马尾松GGPS的同源性为78.07%.系统进化树分析显示,思茅松GGPS与马尾松GGPS的亲缘关系最近.荧光定量PCR分析表明,在思茅松的树皮中,GGPS基因的表达明显受到割脂物理伤害的诱导,在高产脂思茅松个体幼枝中的表达量远远高于在低产脂思茅松个体的表达量.

为深入研究金花茶花瓣类胡萝卜素合成的分子机理,在成功提取金花茶花瓣总RNA的基础上,利用同源克隆和RACE技术克隆得到了异戊烯焦磷酸异构酶基因的cDNA序列全长,命名为CnIPI。碱基序列分析表明:CnIPI基因全长916 bp,包含有一个长度为747 bp编码248个氨基酸的开发阅读框。生物信息学分析表明:该基因编码的CnIPI蛋白质分子量为27.97 kD,为稳定亲水性蛋白,无信号肽;CnIPI蛋白的二级结构以无规则卷曲为主,β-折叠所占比例最少;CnIPI蛋白含有一个典型的异戊烯焦磷酸异构酶结构域。氨基酸序列同源性分析结果表明:CnIPI蛋白与茶、月季、杜鹃等植物IPI蛋白的同源性高于86%。CnIPI基因的克隆使全面理解金花茶花瓣类胡萝卜素合成的分子途径取得了新的突破,为进一步深入研究CnIPI基因的功能及金花茶花瓣类胡萝卜素合成的分子机理奠定了良好的理论基础。

采用cDNA末端快速扩增方法,获得了番木瓜果实GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶(GMP)基因的cDNA全长序列,将其命名为CpGMP,GenBank登录号为FJ489652.然后,根据拼接序列设计开放性阅读框上、下游引物,扩增得到了CpGMP基因的开放性阅读框序列和DNA序列.ORF序列编码361个氨基酸,DNA序列包含4个外显子和3个内含子.序列分析表明,番木瓜GMP与大果黄褥花、桃、番茄、拟南芥、水稻GMP的同源性分别为90.30%、89.47%、88.92%、88.09%、85.87%.半定量RT-PCR分析表明,CpGMP基因随着番木瓜果实的成熟表达量逐渐增加,软化时又逐渐降低.

【目的】克隆橡胶树转录因子HbERF1,分析其在橡胶树中响应非生物胁迫的表达模式,并通过在拟南芥中过表达鉴定其生物学功能,为橡胶树抗逆育种提供基因储备。【方法】利用RACE技术从巴西橡胶树中克隆到HbERF1全长序列,通过qRT-PCR技术分析其在非生物胁迫下的时空表达特性;通过农杆菌介导法转化拟南芥,利用Southern杂交和qRT-PCR技术对过表达植株进行鉴定,并分析过表达植株在干旱、高盐和PEG等胁迫条件下的表型及相关基因的表达特性,验证HbERF1的生物学功能。【结果】橡胶树转录因子HbERF1没有内含子,GenBank登录号为JQ914647,cDNA序列全长为1 178 bp,包...

2-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环焦磷酸合酶(MDS)基因曾被认为是调控植物2-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸(MEP)途径的一个关键节点。为解析杜仲MDS基因序列信息和预测基因功能,以叶片cDNA为模板,采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)及cDNA末端快速扩增(RACE)技术分离出杜仲MDS基因的cDNA克隆,并通过一系列生物信息学方法进行序列分析。结果表明:EuMDS基因cDNA全长976 bp,5′端非编码区长119 bp,3′端非编码区长146bp,编码236个氨基酸。推导EuMDS氨基酸序列中包含转运肽序列(A1~A56)以及多个植物MDS蛋白保守的功能位点(A84,A87,A8...

１－脱氧－Ｄ－木酮糖－５－磷酸合酶（ＤＸＳ）是甲基–Ｄ–赤藓醇–４–磷酸（ＭＥＰ）途径中的第一个酶，也是限速酶。本文根据思茅松（ＰｉｎｕＳ ｋＥＳｉｙａ ｖａｒ．ｌａｎｇｂｉａｎＥｎＳｉＳ（ａ．ＣｈＥｖ．）ｇａｕＳＳＥｎ）树皮转录组数据分析结果，获得思茅松ＤＸＳ基因片段，然后根据获得的基因片段设计特异引物，运用ｒＴ－ＰＣｒ和ｒａＣＥ技术从思茅松树皮中克隆得到完整的ＤＸＳ基因（Ｐｋ ＤＸＳ１）。Ｐｋ ＤＸＳ１基因的Ｃ Ｄｎａ全长序列２ ８８８ ｂＰ，含有１个２ ２２３ ｂＰ的开放阅读框（ＯｒＦ），编码７４０个氨基酸，该基因推断的蛋白与赤松（ＰｉｎｕＳ ＤＥｎＳｉＦｌＯｒａ ＳｉＥｂＯｌＤ＆ＺｕＣ．．．

【目的】研究小麦条锈菌果胶酶基因ＰｓＰＬ１的功能，确定其在小麦条锈菌侵染过程中的作用，为揭示小麦与病原菌互作的分子机理奠定理论基础。【方法】利用ＲＡＣＥ技术扩增ＰｓＰＬ１基因全长，通过ｑＲＴ－ＰＣＲ对ＰｓＰＬ１的表达特征进行分析，并在酵母系统中验证其编码蛋白信号肽的分泌功能，最后通过ＨＩＧｓ技术沉默ＰｓＰＬ１基因，确定其在条锈菌侵染小麦过程中的作用。【结果】克隆得到ＰｓＰＬ１基因全长，其ＯＲＦ长４７１ｂＰ，编码１５７个氨基酸；经预测ＰｓＰＬ１蛋白包含一个果胶酶保守结构域，Ｎ端含有一段由２１个氨基酸组成的信号肽序列；经酵母系统验证，确定ＰｓＰＬ１蛋白信号肽具有分泌功能；ｑＲＴ－ＰＣＲ分析发现，Ｐ．．．

【目的】Pbs2是MAPK信号途径HOG-MAPK通路的重要成员之一,在植物病原菌渗透压调节方面发挥着重要作用。橡胶树白粉病菌(Oidium heveae)是专性寄生菌,论文借助橡胶树炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides),研究橡胶树白粉病菌OhPbs2的功能。【方法】采用同源克隆方法,分别以橡胶树白粉病菌基因组DNA和c DNA为模板,PCR扩增OhPbs2;利用生物信息学分析该基因的结构域,对该基因和其他真菌的7个同源蛋白序列进行系统进化分析,并利用MEGA6中最大简

【目的】探究灯盏花叶片数相关基因磷酸蛋白酶1（EbPP1）的功能，为揭示灯盏花叶片数目和开花时间分子机理奠定基础。【方法】从灯盏花叶片克隆EbPP1基因，将其构建至植物过表达载体RP101。用蘸花法侵染刚抽薹拟南芥植株进行异源表达，通过筛选获得若干株T_(1)、T_(2)、T_(3)代拟南芥阳性植株。最后统计T_(3)代阳性植株叶片数目和开花时间，通过实时荧光定量（RT-qPCR）检测EbPP1表达量，并测定拟南芥植株内源激素含量。【结果】成功克隆到全长EbPP1基因，并构建了该基因的重组过表达载体RP101-GFP-EbPP1。在拟南芥中实现了稳定的遗传转化，于T_(3)代中获得24株阳性EbPP1转基因植株，并对T_(3)代阳性植株进行实时荧光定量分析，RT-qPCR结果显示转基因拟南芥中EbPP1基因过量表达，其表达量从野生型的1.034增加至136.33；转基因拟南芥在表型上呈现出叶片数增多、开花时间延迟的特征；通过LC-MS定量测定植株内源激素含量显示，T_(3)代转基因拟南芥中吲哚-3-甲酸（ICA）和赤霉素24（GA24）等多种激素的含量明显高于野生型，其中生长素前体物质L-色氨酸（TRP）尤为显著，达到了野生型的3倍。【结论】本研究成功在拟南芥植株中异源表达EbPP1基因，与野生型相比，转基因拟南芥中叶片数增多，EbPP1基因表达量增高，内源激素含量升高。基于上述结果表明EbPP1可能通过调控植物激素水平，进而影响灯盏花叶片数目和开花时间。本研究为进一步解析灯盏花叶片数目发育相关机制和开花分子机理奠定基础，同时也为选育高品质灯盏花新品种提供一定的遗传基础。

【目的】核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)是参与植物光合作用的第1步碳同化的关键酶,而Rubisco活化酶(RCA)能够使Rubisco处于稳定的催化活性状态,从而提高光合效率。本研究从毛果杨中克隆RCA基因并通过遗传转化南林895杨,获得PtRCA高表达的转基因株系,并进行分子检测及相关功能分析,为培育杨树新型高光效抗逆品种提供依据。【方法】基于毛果杨基因组数据库信息克隆PtRCA基因序列,利用生物信息学对PtRCA基因进行功能和结构分析。采用Gateway技术将PtRCA构建到植物表达载体