本实验通过双向凝胶电泳技术(2-DE)比较橡胶死皮树与健康树胶乳黄色体蛋白表达谱的差异,通过软件分析比较获得37个差异表达的蛋白点,经基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析后,搜索NCBInr数据库,结果表明,有11个蛋白点被成功鉴定,其中7个为未知蛋白,其余4个蛋白分别为chloroplast 23 kDa polypeptide of photosystem II、ATP synthase beta chain、NADP-dependent sorbitol-6-phosphate dehydrogenase和vitamin-b12 independent met...

【目的】构建橡胶树胶乳均一化全长cDNA文库,降低胶乳中存在的高丰度表达基因的拷贝数,提高胶乳表达基因的分离鉴定和EST测序分析效率。【方法】以橡胶树无性系热研7-33-97的胶乳为材料,将胶乳全长cDNA与Gateway供体载体pDONR222重组,构建了橡胶树胶乳的非剪切型全长cDNA原始文库,经检测原始文库的滴度为6.0×106 cfu/mL,平均插入片段长度大于1.5 kb,重组率约为100%,全长cDNA比例约为76%;利用基因组DNA饱和杂交技术对胶乳原始cDNA文库进行均一化处理,构建橡胶树胶乳的均一化全长cDNA文库。【结果】胶乳均一化全长cDNA文库的总库容量(总CFU)为1...

采用巴西橡胶树常割树胶乳的Poly(A+)RNA为Tester,叶片Poly(A+)RNA为Driver,通过抑制消减杂交法(suppressivesubtractivehybridization,SSH)构建了一个胶乳特异表达基因差减文库,通过菌落PCR及反式NorthernDot-Blot筛选鉴定阳性差异片段,获得79个胶乳特异表达阳性克隆,部分阳性克隆还通过NorthernBlot杂交及RT-PCR进一步验证。随机挑选部分阳性克隆序列比较分析,结果表明有部分克隆与巴西橡胶树中已知的基因相同,而多数克隆在巴西橡胶树中是新发现,它们与橡胶生物合成、物质代谢运输、信号传导和形态建成等相关。

【目的】天然橡胶生物合成途径是典型的植物类异戊二烯代谢途径，MVA代谢途径是天然橡胶与萜类化合物所需的五碳构成单元IPP和DMAPP生物合成的主要途径之一。由2分子IPP和1分子DMAPP聚合形成的法尼基焦磷酸是乳管细胞天然橡胶生物合成的起始前体，厘清该起始物的合成酶酶学性质不仅有助于阐明天然橡胶生物合成机制，同时也为天然橡胶遗传改良提供酶学理论基础。【方法】对橡胶树热研7-33-97基因组中同源的3个预测的法尼基焦磷酸合成酶(HbFPS1、HbFPS2、 HbFPS3)进行序列特征分析，优选胶乳中高表达的2个法尼基焦磷酸合成酶基因构建原核表达载体，经蛋白纯化与MALDI TOF质谱确证，并同时进行体外酶活性检测，最终评价其对体外橡胶合成效率的影响。【结果】橡胶树基因组含有的3个预测的法尼基焦磷酸合成酶都含有特征性的2个保守结构域“DDIMD”和“DDYXD”及相似的三维空间结构，其中胶乳高表达的HbFPS1和HbFPS2基因编码的蛋白氨基酸序列相似性达到95%,说明HbFPS1和HbFPS2 2个冗余基因可能经历了基因组中同源基因的后期拷贝事件。同时HbFPS1和HbFPS2基因能够正确地在大肠杆菌中表达，HbFPS3却难以正确折叠而形成包涵体，体现了这2类蛋白质N末端氨基酸明显的亲疏水性差异对蛋白可溶表达的影响。HbFPS1和HbFPS2蛋白在体外除了能够利用GPP为底物合成FPP外，还能够直接转化IPP和DMAPP生成FPP。同时，分别添加HbFPS1和HbFPS2蛋白能够提高体外橡胶合成效率并且存在蛋白剂量相关性特征。与对照相比，在特定的反应体系中，当HbFPS1和HbFPS2蛋白添加量增加时体外橡胶合成效率随之不同程度地提高，且在100μg时促进作用最明显。【结论】橡胶树胶乳中高表达的2个冗余基因HbFPS1和HbFPS2与HbFPS3基因编码蛋白的序列差异可能影响酶的活性。HbFPS1和HbFPS2蛋白确证是胶乳中能够促进天然橡胶合成的功能酶，而且能够直接聚合IPP和DMAPP生成天然橡胶合成起始物FPP。本研究建立了基于天然橡胶粒子的体外蛋白功能研究平台，并证明HbFPS1和HbFPS2酶在一定的含量下能够显著地提升橡胶合成效率。通过调控HbFPS1和HbFPS2酶活性将有助于橡胶树优质高产品种的改良与选育。

研究未刺激、乙烯利刺激、乙烯气体刺激胶树微割排胶影响面内不同高度部位胶乳的蔗糖、无机磷、总固形物含量和水势,并比较分析同种处理割胶前后及不同处理间割胶前后胶树胶乳中这些生理参数的差异变化,结果表明:乙烯气体刺激较其他2种处理能够较明显扩大胶树排胶影响面,有利于增加胶树胶乳产量。并提出用开割前和停排后的胶乳干含差来指导割胶生产。

利用非洲爪蟾卵母细胞对橡胶树水通道蛋白基因HbPIP1和HbPIP2进行功能鉴定,发现HbPIP1具有快速水分传输功能而HbPIP2不具该功能。推测HbPIP1基因表达可能与乙烯利刺激橡胶树增产机制有关。因此,选择对乙烯利较敏感的橡胶树PR107品种,利用RT-qPCR和Western blot技术检测HbPIP1在转录和翻译水平的表达变化,探讨其与乙烯利刺激后橡胶树排胶体积、排胶时间、干含和总固形物变化的关系。结果表明:HbPIP1在树皮、胶乳和次生木质部中具有较高的表达量;胶乳中HbPIP1的表达量随乙烯利刺激时间延长呈上升趋势,而树皮中HbPIP1的表达量则呈降低的趋势;乙烯利通过调节H...

为探寻肌动蛋白解聚因子（ａｃｔｉｎ ｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ，ａｄｆ）在调控肌动蛋白解聚和聚合平衡过程中发挥的作用，从橡胶树中获得了Ｈｂ ａｄｆ基因组序列，经测定，该序列长２ ２５８ ｂｐ，含有２个内含子和３个外显子，在裂殖酵母中过表达Ｈｂ ａｄｆ，获得相对分子质量约３８ ０００的融合蛋白。对裂殖酵母细胞形态进行观察，发现诱导表达Ｈｂ ａｄｆ的酵母细胞长度显著增加，双核和多核比例达６７％。实时荧光定量ｐｃｒ结果表明，Ｈｂ ａｄｆ的表达受３％Ｋｉ处理调控，在橡胶树不同死皮阶段和不同排胶时间段的表达存在变化，说明Ｈｂ ａｄｆ可能参与了橡胶树排胶和死皮的过程。

【目的】揭示橡胶树胶乳主要生理参数与产量的相关性,从橡胶树群体后代中筛选具有高产潜力的优异种质材料。【方法】测定橡胶树热研2-73×PB5/51F1群体的胶乳生理参数,采用方差分析、相关分析、主成分分析、聚类分析和判别分析等方法,对橡胶树群体的胶乳生理参数进行分析。【结果】热研2-73×PB5/51F1群体中37个单株间的干胶产量(DRY)、胶乳产量(LY)、总固形物含量(TSC)、C-乳清蛋白含量(PC)、转化酶活性(IA)和蔗糖浓度(SC)差异均达极显著水平;DRY、LY与IA、PC呈显著正相关。选出2个主成分进行分析,2个主成分的方差累计贡献率达67.10%;对DRY、LY、TSC、PC...

采用毛细管柱气相色谱法测定橡胶树胶乳中的乙烯含量,并初步测定了乙烯刺激割胶不同割次的乙烯含量及其变化.该方法的线性范围为11.6-581.4μL.L-1,检测限为1.12μL.L-1,相对标准偏差(RSD)为1.01%.橡胶树采用乙烯利刺激(S/2 D/2+2.5%ET),涂药后第1-3割次的胶乳乙烯释放量分别为:151.6、31.1、17.5μL.L-1,而未经刺激的橡胶树(对照)乙烯含量低于检出限;第1-3割次的胶乳乙烯生成速率分别为:2.823、0.578、0.324 nL.g-1.h-1,表明经乙烯利刺激后,胶乳中的乙烯含量大量增加,生成速率发生了明显变化,均大于对照,且随割次的增多而...

采用RT-PCR技术从橡胶树的叶片中分离到一条852 bp的c DNA,该序列包含一个798 bp的开放读码框(ORF),21 bp的5’UTR和33 bp的3’UTR;ORF预测编码265个氨基酸,理论分子量为28.64 k Da,等电点为5.55,属于叶绿体定位的类囊体膜蛋白;蛋白含有1个保守的叶绿素结合结构域,3个跨膜螺旋和2个C端螺旋,1个三聚化基序,以及多个叶绿素和类胡萝卜素结合位点,隶属于LHCB1亚家族;蛋白与蓖麻(Ricinus communis)、葡萄(Vitis vinifera)和棉花(Gossypium hirsutum)中同源蛋白的相似性都在95%以上,显示出高度的保...

半胱氨酸蛋白酶是一类重要蛋白水解酶,其广泛参与植物的生长发育及各种生物与非生物胁迫的应答。根据EST序列信息设计引物,从橡胶树的根中分离到1条1 056 bp的c DNA。该序列包含1个1 023 bp的开放阅读框(ORF),13 bp的5'UTR和20 bp的3'UTR。ORF预测编码340个氨基酸,相对分子质量为37 350,等电点为5.24,属于液泡定位的分泌型蛋白。该蛋白含有1个Inhibitor_I29和1个Peptidase_C1A结构域,可归为木瓜蛋白酶C1家族。该蛋白与蓖麻(Ricinus communis)和杨树(Populus trichocarpa)中同源蛋白的相似性都在...

橡胶树死皮是影响天然橡胶产量的重要因子之一。本研究采用3种药物开展橡胶树死皮防治试验。结果表明,施药后,1号药剂(INS宝卡有机液肥)和3号药剂(奥普尔腐植酸水溶液肥料)处理的橡胶树死皮发病率和发病指数均呈下降趋势,而2号药剂(千叶液肥)处理的几乎无变化;从防效来看,1号药剂的防效最高(22.4%),其次是3号药剂(20.3%),2号药剂最低(6.9%);从3种药剂对产量的影响来看,1号药剂的平均干含、平均胶乳产量及干胶产量均最高,3号药剂次之,2号药剂最低。由此得出,1号药剂的防治效果最佳,其次是3号药剂,而2号药剂的防治效果不明显。本研究能为胶农合理选择死皮防治药剂及开发更高效的死皮防治药...

【目的】分析巴西橡胶树(Hevea Brasiliensis Müll.Arg.)橡胶粒子的蛋白质构成,探索未知的橡胶粒子蛋白质。【方法】采用16-BAC/SDS PAGE双向电泳分离橡胶粒子蛋白质,采用MALDI/TOF-TOF质谱技术进行蛋白质鉴定;此外,利用磺基异硫氰酸苯酯(SPITC)化学辅助质谱测序法进行肽段的从头测序,获得未知蛋白质肽段的氨基酸序列。通过搜索橡胶树胶乳转录组测序获得的EST数据库,获取已知部分氨基酸序列蛋白质的全序列,或通过部分肽段获取为未知蛋白质编码的EST序列。【结果】获得了橡胶粒子蛋白质的16-BAC/SDS-PAGE双向电泳图谱,鉴定了17个橡胶粒子蛋白质;...

本研究采用Ａ、Ｂ和Ｃ ３种以壳聚糖为载体的死皮防治药剂开展橡胶树重度死皮（４、５级）的防治试验。结果表明：各处理区死皮长度恢复率依次为：Ｃ（５５．８４％）＞Ａ（２７．５７％）＞Ｂ（２０．１１％）＞ＣＫ（１４．９７），平均单株胶乳产量依次为：Ｃ（４５．２０ ｍ Ｌ）＞Ａ（３９．７４ ｍ Ｌ）＞Ｂ（２７．５０ ｍ Ｌ）＞ＣＫ（１８．０８ ｍ Ｌ），两者变化趋势一致，３种药剂的防效依次为：Ｃ（３１．９１％）＞Ａ（１６．１９％）＞Ｂ（８．８３％）。由此可判断，该３种壳聚糖基死皮防治药剂对重度橡胶树死皮都具有一定的防效，其中Ｃ药剂效果最佳，达到显著水平，其次为Ａ药剂和Ｂ药剂。本研究提供了一种对橡胶树重度．．．

【目的】研究乙烯利过度刺激采胶所诱导的橡胶树死皮发生、发展过程中的胶乳产量和生理变化规律,为利用乙烯利刺激增产以及采取有效措施预防死皮发生提供理论依据。【方法】选择橡胶树品种‘热研7-33-97’健康植株,通过乙烯利过度刺激采胶诱发不同等级死皮,测定分析不同等级死皮植株胶乳产量和相关生理指标的变化规律,包括p H值、黄色体破裂指数、干胶含量、总固形物含量、硫醇含量、无机磷含量、橡胶粒子粒径分布及平均粒径等。【结果】1)在乙烯利过度刺激采胶过程中,胶乳产量呈先升后降的变化趋势。在刺激割胶早期阶段,胶乳产量不断增加,普遍增产3倍以上,但很快会诱发死皮。随着死皮发生、发展,胶乳产量逐渐下降,最终低于健康植株。2)黄色体破裂会导致乳管堵塞,黄色体破裂指数随植株死皮等级提高而显著提高,这与死皮发生有直接关系。死皮植株的胶乳p H值也略有上升,但仅3级死皮植株与健康植株具有显著差异。3)乙烯利过度刺激对胶乳具有稀释效应,死皮植株胶乳干胶和总固形物含量均低于健康植株,其中2～3级死皮植株中的含量递减,而4～5级死皮植株中的含量逐步回升。4) 2～3级死皮植株的胶乳硫醇含量递增,均显著高于健康植株,而4～5级死皮植株中的含量逐步回落,与健康植株无明显差异。2～5级死皮植株的胶乳无机磷含量呈递减趋势,但均高于健康植株。5)健康植株的胶乳橡胶粒子粒径在0.09～2.27μm范围呈单峰分布。随植株死皮发生发展,胶乳橡胶粒子粒径分布向小粒径方向逐步偏移,且峰值逐渐下降。与之相符,胶乳橡胶粒子平均粒径亦随死皮等级提高而逐渐变小,2～5级死皮植株的平均粒径均显著低于健康植株。健康植株的胶乳橡胶粒子平均粒径为0.89μm,而5级死皮植株的平均粒径仅0.79μm。【结论】乙烯利过度刺激采胶会促使胶乳黄色体破裂增加、硫醇和无机磷大量外排、橡胶粒子变小,从而导致乳管系统受损与堵塞,影响橡胶生物合成和胶乳外排,表现出死皮症状。天然橡胶生产中应合理使用乙烯利刺激,避免因过度刺激诱发死皮造成减产。