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[期刊] 中国农业科学
[作者]
李平 桑贤春 裴炎 何光华
【目的】大多数的植物防御素对不同的病原菌具有抗菌活性,其中来自苜蓿种子的防御素alfAFP的转基因土豆和番茄已经被证明对病原菌具有强抗病性。进一步研究该基因对稻瘟病、纹枯病、白叶枯病三大重要病害的抑制作用,对水稻抗病基因工程研究具有重要的意义。【方法】本试验将alfAFP构建到表达载体pPIC9K上,电转化毕赤酵母(GS115),再进行蛋白质的分泌性诱导表达,最后进行体外重组蛋白对水稻病菌的抑菌活性检测。【结果】通过15%的SDS-PAGE检测,得到大约6.5kD的重组蛋白。alfAFP融合蛋白对水稻纹枯病、稻瘟病和白叶枯病均具有一定的抑制活性,其中对纹枯病的作用最为明显。【结论】alfAFP...
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
吕星星 王莎莎 赵震 陶妍 谢晶 钱韻芳
β-防御素是一类富含半胱氨酸的阳离子小分子抗菌肽，是机体特异性免疫系统中的重要蛋白质免疫因子。鳜鱼β-防御素(Siniperca chuatsi β-defensin，ScBD)多肽链由N端的信号肽和C端的成熟肽组成，通过构建产鳜鱼β-防御素的毕赤酵母重组菌株，以解决天然免疫小分子抗菌肽的来源问题。首先通过RT-PCR从鳜鱼脾脏中分离编码β-防御素成熟肽的基因ScBD，将其与表达载体pPICZαA连接后构建重组表达载体pPICZαA-ScBD并转入毕赤酵母X-33；通过含高浓度博来霉素的YPD平板筛选阳性转化子后，于28 ℃、250 r/min和pH 6.0的条件下，使用1%甲醇诱导表达96 h；经镍离子亲和层析对重组毕赤酵母菌株的产物进行纯化，并对纯化产物进行MALDI-TOF/TOF质谱鉴定；通过平板涂布法和浊度法检测该重组菌株产物的抑菌活性。结果表明：基于质谱分析的一级结构鉴定证明纯化产物为分子量6.35 ku的预期重组ScBD；抑菌试验显示重组菌株产物对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）的抑制率分别为94.34%、86.97%和85.92%。本文构建的重组毕赤酵母菌株能有效合成具有生物学活性的重组ScBD，为鱼类来源天然小分子抗菌肽的进一步开发提供了可资参考的技术途径。
[期刊] 华北农学报
[作者]
皇甫海燕 燕孟娇 宋培玲 郝丽芬 皇甫九茹 贾晓清 李子钦
为探讨ＰＧＩＰ蛋白与ＰＧ的互作及ＰＧＩＰ基因在油菜抗黑胫菌病中的作用，根据Ｇｅｎ Ｂａｎｋ中油菜ＰＧＩＰ９、ＰＧＩＰ１５ＣＤＳ序列设计引物，并去掉信号肽序列，以接种黑胫病病原菌ＬｅＰｔｏＳＰｈａｅｒＩａ ＢＩＧＬｏＢｏＳａ（菌株ｎＭ－１）７ Ｄ后油菜叶片总ｒｎａ反转录的Ｃ Ｄｎａ为模板，ＰＣｒ扩增出ＰＧＩＰ９、ＰＧＩＰ１５除信号肽以外的编码区片段，并克隆到巴斯德毕赤酵母表达载体Ｐ ＰＩＣＺαａ中构建重组质粒Ｐ ＰＩＣＺαａ－ＰＧＩＰ９、Ｐ ＰＩＣＺαａ－ＰＧＩＰ１５。重组质粒经单、双酶切、菌落ＰＣｒ筛选鉴定后热激化法转化酵母细胞ＰＭａＤ１６，再经ＺｅｏＣＩｎｔＭ的ＹＰＤ平板和菌落ＰＣｒ筛选鉴定．．．
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
姚静 胡云峰 王艳 张风荣 侯加法
为了在毕赤酵母中表达鸡骨保护素(chOPG),采用DNA重组技术将鸡OPG成熟肽cDNA片段插入毕赤酵母表达载体pPICZα-A中,以电穿孔法转化酵母X-33,用Zeoc in平板筛选阳性重组子,经甲醇诱导,实现了OPG在毕赤酵母中的分泌表达。SDS-PAGE电泳分析结果显示,表达产物存在两种形式,其相对分子质量分别为43000和53000,表达量约为200 mg.L-1,经免疫印迹验证,有较好的抗原性。表达产物经处理后加入到体外培养的鸡胚破骨细胞上,能显著抑制成熟破骨细胞的骨吸收活性,减少骨吸收陷窝的个数与面积。
关键词：
鸡骨保护素 毕赤酵母 分泌表达 破骨细胞
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
王秀青 张素芳 曹瑞兵 周斌 陈溥言
通过重叠区扩增基因拼接法(SOE)合成抗菌肽天蚕素B基因,并在其N端引入Kex2酶切位点。亚克隆天蚕素B并将3个亚克隆串联在一起,每个单体前都加上Kex2酶切位点,将天蚕素B以及串联体克隆至表达载体pPICZαA上,用SacⅠ酶切使之线性化,采用电击法转化毕赤酵母SMD1168,转化子用小瓶发酵。经Tricine-SDS-PAGE检测,在α信号因子的引导下,表达产物可以分泌到培养基中,且具有明显抑菌活性。
[期刊] 淡水渔业
[作者]
谢帝芝 刘臻 王赏初 张建设 肖调义 鲁双庆
根据GenBank数据库中登记的青鱼(Mylopharyngodon picens)生长激素(bcGH)基因序列(AF389238)设计特异性引物,采用RT-PCR技术扩增青鱼生长激素cDNA编码区,并通过定向插入含强启动子AOX I的表达载体pPIC3.5k、电击转入毕赤酵母GS115菌株、G418多克隆子筛选和测序验证等步骤进行了重组生长激素酵母菌诱导表达等相关实验,成功获得重组生长激素酵母菌(pPIC3.5k-bcGH重组酵母菌)。蛋白表达产物经SDS-PAGE和ELISA检测,在23 kD处发现一条与预期蛋白分子量大小一致的特异性条带,并且目的蛋白能与青鱼生长激素多克隆抗体特异性结合,...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李荣荣 和祯泉 鲍恩东 陈溥言
【目的】研究鸡源重组抗菌肽Fowlicidin-3的生物学特性,并为重组抗菌肽在临床上的应用奠定基础。【方法】根据抗菌肽数据库中Fowlicidin-3的氨基酸序列,选用毕赤酵母的偏嗜密码子,设计抗菌肽的基因,通过SOE法合成得到全长为114bp的Fowlicidin-3基因。将Fowlicidin-3基因克隆入pPICZα-A质粒,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα-A-F。将线性化重组表达载体pPICZα-A-F通过电击法转入毕赤酵母宿主菌X-33中,构建分泌型重组酵母表达菌株。【结果】获得分泌型重组酵母表达菌株,Fowlicidin-3多肽表达量达到170mg·L-1,对致病性大肠杆...
[期刊] 淡水渔业
[作者]
王树云 李江宇 高志强 谷强 蒲静 任彤 张伟 张旻 江育林 武勇 张利峰
根据Gen Bank中鲤春病毒血症病毒(SVCV)糖蛋白全基因序列设计特异性引物,以SVCV欧洲株病毒核酸为模板,通过RT-PCR方法获得欧洲株SVCV-G基因,克隆至p PICZαA,构建p PICZαASVCV1540表达质粒。以限制性内切酶Sac I线性化p PICZαASVCV1540后通过化学法转化毕赤酵母感受态细胞X33和GS115,添加1%甲醇进行诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表达产物显示其分子质量为70 ku。Western Blot分析显示该蛋白可以被SVCV山羊多抗识别,表明目的蛋白具有反应原性。
关键词：
鲤春病毒血症病毒 糖蛋白 毕赤酵母
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
曹瑞兵 王艳 魏建超 陈溥言
亚克隆犬α1干扰素(CaIFN-α1)成熟蛋白编码基因并克隆到表达载体pPICZα-A,构建转移重组载体pPICZα-A-CaIFN-α。pPICZα-A-CaIFN-α经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X-33。转化子经PCR分析鉴定后利用甘油增菌和甲醇诱导,实现了CaIFN-α1在毕赤酵母系统中的分泌表达。SDS-PAGE检测结果表明表达产物相对分子质量约为2.7×104,比其推导结果(约1.9×104)大,推测可能是发生了糖基化。酵母分泌表达的CaIFN-α1具有较高的抗病毒活性,约为1.45×106U·mL-1,蛋白含量约为96mg·L-1,比活性为1.49×107U·mg-...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
张桂敏 张晚鸣 何国帮 马立新
根据文献报道的烟曲霉植酸酶序列,设计引物以烟曲霉CCTCCAF93044的总DNA为模板进行梯度PCR,扩增出了1条约1.4 kb的带,将该片段进行DNA序列测定,其序列与已报道的烟曲霉植酸酶序列完全一致,但只编码完整的成熟植酸酶序列。将该片段克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K上,获得表达质粒pHBM108。该质粒转化毕赤酵母KM71所得重组子经PCR验证后进行诱导表达,其中一重组子经144 h诱导,植酸酶表达量至少为1.25 mg/ml,比同类报道的表达量高出60％以上,以植酸钠为底物测得酶活为11.17U/ml。
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
周洁 陈鑫 郑祥梓 林成增 王宗华 鲁国东
本研究从稻瘟病菌菌株Guy11中提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增到一假定几丁质酶基因MGG_08054.6的cDNA序列,将其亚克隆至带有His-tag标签的酵母表达载体pPIC3.5K中,构成重组质粒pPIC3.5K-ws,电击转化至毕赤酵母菌菌株GS115,通过MD-MM平板筛选及PCR验证获得重组酵母转化子GS115-PICH-ws;阳性转化子在甲醇诱导下,成功分泌出重组蛋白.SDS-PAGE分析表明,重组蛋白分子质量为48 ku,与其理论计算值基本相符;Ni-NTA法分离纯化后的重组蛋白经DNS法测定具有几丁质酶活性.
关键词：
稻瘟病菌 几丁质酶 毕赤酵母 表达
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
唐升斌 矫庆华 谢达平
通过PCR方法扩增得到无信号肽无内含子的酸性植酸酶phyB基因,将此基因克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9K上,并转化毕赤酵母GS115感受态细胞,获得重组毕赤酵母.在甲醇的诱导下,该植酸酶phyB基因在毕赤酵母中得到表达.经SDS-PAGE凝胶电泳分析,该重组蛋白的相对分子质量为7.5×104,而该植酸酶在大肠杆菌DH5α表达系统中表达的相对分子质量为6.0×104,这可能是由于糖基化的结果.酶学性质检测发现,表达的植酸酶最适作用温度为65℃,比野生原始菌株的提高了10℃;诱导pH值为5.5时,蛋白的表达量最高,为10 528.6 U/mL,是野生菌株的2.8倍;最适作用pH值为2.5;在70...
[期刊] 华北农学报
[作者]
宋玛丽 王茜 杜军 赵峰梅 梁爱华
对来源于大肠杆菌的植酸酶基因ａｐｐ ａ进行突变获得植酸酶基因突变体ａｐｐ ａ－２ＱＮ，利用酵母表达系统在摇瓶培养条件下表达后，该植酸酶突变体显示出良好的热稳定性。为提高该植酸酶的表达量，降低植酸酶的生产成本，对表达该酶的重组酵母菌ＧＳ１１５／ａｐｐ ａ－２ＱＮ进行了高密度发酵研究，通过控制发酵过程中碳源（甘油）的添加使得菌体生长达到一定密度，从而实现高效表达。在诱导蛋白质表达阶段，发酵液中甲醇的含量影响植酸酶的表达量，利用变色酸分光光度法对甲醇含量进行了检测分析。结果表明，在５ Ｌ发酵罐中进行高密度发酵１４７ ｈ后，菌体浓度ＯＤ６００Ｎｍ达到３１３，通过将甲醇浓度控制在２．５％左右，经过诱导１．．．
[期刊] 华北农学报
[作者]
宋玛丽 王茜 杜军 赵峰梅 梁爱华
对来源于大肠杆菌的植酸酶基因app A进行突变获得植酸酶基因突变体app A-2QN,利用酵母表达系统在摇瓶培养条件下表达后,该植酸酶突变体显示出良好的热稳定性。为提高该植酸酶的表达量,降低植酸酶的生产成本,对表达该酶的重组酵母菌GS115/app A-2QN进行了高密度发酵研究,通过控制发酵过程中碳源(甘油)的添加使得菌体生长达到一定密度,从而实现高效表达。在诱导蛋白质表达阶段,发酵液中甲醇的含量影响植酸酶的表达量,利用变色酸分光光度法对甲醇含量进行了检测分析。结果表明,在5 L发酵罐中进行高密度发酵147 h后,菌体浓度OD600nm达到313,通过将甲醇浓度控制在2.5%左右,经过诱导1...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
李雯 陶妍
从鲤鱼鳃组织中分离克隆到一种新的g型溶菌酶同工型基因(CLYG).该基因的全长cDNA为558 bp,除去终止密码子,编码185个氨基酸,推断的氨基酸序列没有信号肽,含3个催化位点(谷氨酸73、脯氨酸86和天冬氨酸97),具有鱼类g型溶菌酶的基本特征.通过PCR方法在CLYG基因的5'和3'端分别引入XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点.扩增到的目的片段与表达载体pPICZαA连接构建重组表达载体pPICZαA-CLYG后,电转至毕赤酵母X-33,筛选得到的阳性转化子在1.0%甲醇、29℃、pH 6.0的条件下诱导
关键词：
鲤鱼 g型溶菌酶 毕赤酵母 重组表达
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