植物蛋白酶抑制剂是除Bt之外又一个愈来愈研究较多的抗虫基因资源,其分布广泛,在豆科、茄科、禾本科、葫芦科及十字花科等植物中存在较多。植物蛋白酶抑制剂抗虫基因主要通过2种途径获得并在多种植物中进行转化,获得抗虫转基因植株。植物蛋白酶抑制剂在林木抗虫基因工程中的应用刚刚起步。本文在总结我国林木病虫害防治现状的基础上,阐述植物蛋白酶抑制剂在林木抗虫基因工程中的应用前景,同时也探讨植物蛋白酶抑制剂在林木害虫防治应用中存在的问题及解决途径。

该文从核桃种子中分离纯化具有抑菌活性的胰蛋白酶抑制剂，分析其抑菌活性，并过测量其抑菌圈的大小来确定其抑菌能力的强弱。实验选用湖北省武汉市８５１８核桃为原料，采用Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ－ＤｅＡｅ５２阴离子交换层析、ｓｅｐｈＡｒｏｓｅ４Ｂ－Ｔｒｙｐｓｉｎ亲和层析和Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ离心超滤等分离纯化方法，从核桃种子中分离出一种胰蛋白酶抑制剂，命名为ＷＴｉ。测得纯化的核桃胰蛋白酶抑制剂的抑制率为０．３，对白腐病病原真菌（ｓＣｌｅｒｏＴｉｕＭ ＣｅｐｉｖｏｒｕＭ Ｂｅｒｋ）和叶斑病病原真菌（ＡｌＴｅｒｎＡｒｉＡ ＡｌＴｅｒｎＡｒｉＡ）有一定的抑制作用，并且随着ＷＴｉ蛋白浓度的增加对病原真菌生长抑制愈加明显．．．

虫害是杨树造林生产中所面临的一大难题。通过农杆菌介导 ,将经过人工改造的苏云金杆菌杀虫结晶蛋白 (Bt)基因转化杨树 ,得到杨树再生植株 ,然后 ,再将蛋白酶抑制剂基因 (PI)导入已含Bt基因的转基因杨树 ,经PCR检测和Southern杂交分析证明 ,最终获得既含有Bt基因又含有蛋白酶抑制剂基因的转基因杨树植株。利用这种杨树叶片饲喂舞毒蛾幼虫的杀虫试验结果表明 ,转基因杨树具有明显的杀虫活性 ,同时表明含有Bt基因和蛋白酶抑制剂基因双基因的植株其抗虫能力明显高于仅含单一Bt基因的植株。为探索培育高抗虫性杨树开辟了一条新途径。

沙雷氏蛋白酶属于锌金属蛋白酶M10B亚家族,是一些细菌性疾病的关键致病因子。专一性沙雷氏蛋白酶抑制剂在体外可靶向抑制沙雷氏蛋白酶,从而减弱产沙雷氏蛋白酶的细菌病原体的活性,成为疾病治疗的新思路。沙雷氏蛋白酶MP和其抑制剂Lup I均来源于海洋微生物Flavobacterium sp. YS-80-122,本研究分别纯化了蛋白酶MP、抑制剂LupI及MP-LupI的复合物,对MP-LupI复合物进行结晶条件筛选,成功在2种条件下获得MP-LupI复合物晶体,并经X-射线衍射收集到分辨率达2?的高质量衍射数据,其晶胞空间为P1211,晶胞参数为a=51.66?、b=51.85?、c=102.14?、α=γ=90°、β=97.68°。

采用RACE方法获得了脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin基因的cDNA序列。该基因全长1 516 bp,开放阅读框1 245 bp,编码414个氨基酸,其预测分子量为45.06 kD,理论等电点为5.694,并含有两个糖基结合位点。同源性分析发现其与斑节对虾(Penaeus monodon)同源性最高,达到49%。组织表达分析表明,serpin基因在脊尾白虾血细胞中表达量最高,其次是肝胰腺和鳃组织,在肌肉中表达量最低。不同盐度胁迫后脊尾白虾的血细胞serpin基因表达量在盐度胁迫8 h时显著高于对照组(P<0.05),肝胰腺组织中serpi...

研究了大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)对鲢肌肉中肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(MBSP)引起的肌原纤维蛋白降解作用的影响。大豆胰蛋白酶抑制剂经高度纯化后加入肌原纤维中以判断它对MBSP的抑制效果。在不添加STI的情况下,55℃加热30min即可观察到肌球蛋白重链的分解,延长加热时间则可检测到肌动蛋白及原肌球蛋白的降解。相反,在终浓度为0.75μg·mL-1的STI存在下,包括肌球蛋白重链在内的肌原纤维蛋白降解均能得到有效抑制,表明STI是MBSP的特异性抑制剂。由于肌球蛋白重链及肌动蛋白的完整性是构成鱼糜制品凝胶强度的主要因素,因此,STI的添加有可能提高鲢鱼糜制品的凝胶强度。

本研究探讨了反应温度、pH、金属离子(Zn~(2+)、Mg~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(3+)、Al~(3+)和Ca~(2+))对南极磷虾粗酶液中蛋白酶活性的影响,研究了苯甲基磺酰氟(PMSF)、EDTA·2Na、碘乙酰胺(IAM)和甲苯磺酰–苯丙氨酸氯甲基酮(TPCK)对蛋白酶活性的抑制效果。结果显示,南极磷虾粗酶液中蛋白酶的最适反应温度为40℃;最适反应pH值为8.0;当金属离子浓度为0.5 mmol/L时,Zn~(2+)、Mg~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(3+)和Al~(3+)金属离子对蛋白酶酶活的抑制率分别为55.02%、55.02%、35.39%、20.67%和41.12%,而Ca~(2+)离子对蛋白酶活有明显的促进作用;PMSF和EDTA·2Na对蛋白酶酶活具有较为显著的抑制作用,PMSF的浓度为8.0 mmol/L时,抑制率为60%;EDTA·2Na浓度为0.6 mmol/L时,抑制率为86.67%;IAM在低浓度时有一定的抑制作用;TPCK低浓度时抑制效果不明显,浓度升高时有一定的抑制作用。在5~30℃的温度范围内,随着温度升高,EDTA·2Na对蛋白酶酶活的抑制效果逐渐增加。本研究阐明了影响南极磷虾粗酶液蛋白酶酶活的因素,开发了针对南极磷虾粗酶液中蛋白酶活性的抑制剂,为南极磷虾在食品领域的开发利用提供了基础理论数据。

为了发掘我国乡土树种毛白杨巯基蛋白酶抑制剂(CPI)基因资源,该研究在对已知植物巯基蛋白酶抑制剂氨基酸序列保守性和杨树表达序列标签(EST)序列分析的基础上,设计了1对简并引物和1对杨树特异性CPI引物,应用RT-PCR技术在毛白杨形成层中扩增出了一个696 bp的cDNA片段,将此片段连接到pGEM-T Easy载体上并测序.结果表明,该片段含有一个417 bp的开放阅读框,编码138个氨基酸残基.进一步对氨基酸序列分析表明,该氨基酸具有典型植物巯基蛋白酶抑制剂的保守区段,即靠近氨基端具有甘氨酸(G)残基和[LVI]-[AGT]-[RKE]-[FY]-[AS]-[VI]-x-[EDQV]-[...

为了研究鱼类半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)的功能并探索其在水产品加工和病害防治中的应用潜力,将改造后的中华鲟(Acipensersinensis)cystatinCcDNA亚克隆到原核表达载体pBV220,构建表达cystatinC的大肠杆菌基因工程菌。该工程菌经温度诱导、SDS PAGE检测,在约12.4kD处有一特异蛋白带,该特异蛋白的含量约为菌体总蛋白的25%。重组半胱氨酸蛋白酶抑制剂经洗涤、溶解、透析、复性后纯度为85%,实现了中华鲟cystatinC在大肠杆菌中的高效表达。木瓜蛋白酶活性抑制实验结果表明该重组cystatinC具有明显的酶活抑制作用。

以野生茄托鲁巴姆为材料,在利用SSH文库获得基因片段的基础上,采用RACE方法克隆了1个蛋白酶抑制剂Ⅱ型基因的全长cDNA序列,命名为StPI1。StPI1 cDNA序列全长790bp,含有29bp的5′-UTR和201bp的3′-UTR,编码包含202个氨基酸的前体蛋白。StPI1前体蛋白N末端1~27位为信号肽,成熟蛋白含有3个保守的蛋白酶抑制剂Ⅱ结构域。预测StPI1蛋白含有1个磷酸化位点、1个糖基化位点和3个N端酰基化位点。表达模式分析表明,在黄萎病菌侵染后,StPI1在托鲁巴姆根中呈上调表达。

Serpin家族成员作为主要的丝氨酸蛋白酶抑制剂,通过调节一系列丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶的活性来调节蛋白酶级联反应,进而参与了包括血液凝结、补体激活、纤维蛋白溶解、炎症反应、肿瘤抑制和激素转运等大量的基本生物过程,在调节机体免疫及其它重要生理功能等方面发挥着重要作用。在前期研究中,从中国明对虾血细胞中克隆得到一个serpin型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因(Fc-serpin,GenBank登录号:DQ318857),初步研究显示它在转录水平参与了病原菌和白斑杆状病毒(WSSV)引发的中国明对虾先天免疫应答反应;利用原核重组表达系统,成功获得了重组的中国明对虾serpin型丝氨酸蛋白酶抑制剂(rF...

杨树受损伤后能诱导一些基因的表达,其编码的蛋白质可能在杨树的防卫反应中起一定作用。用PCR方法从新疆杨叶片中克隆出一个损伤诱导型Kun itz胰蛋白酶抑制剂基因PaTI1。序列分析表明:此基因不含内含子,其翻译起点上游具有‘TATA’和‘CCAAT’等转录控制元件,包含的阅读框架能编码一个长为213个氨基酸的多肽。此多肽与克隆自美洲山杨的PtTI2和PtTI1氨基酸序列同源性最高,分别为95%和80%,其N端存在一长度为27个氨基酸的信号肽。将此基因以融合蛋白的形式在大肠杆菌中进行表达,纯化后的融合蛋白对胰蛋白酶的活性有抑制作用,每8.5μg融合蛋白可完全抑制1μg牛胰蛋白酶的活性。W est...

从白鲢(Hypophthalmichthys molitrix)骨骼肌中分离纯化到一种丝氨酸蛋白酶抑制剂,该抑制剂的分子量大约50 kD,用PAGE-明胶电泳证明,该抑制剂对胰蛋白酶具有抑制作用;当温度超过60℃时,抑制剂的活性下降70%左右,但在pH 3~11的范围内均有活性。用MTT法分析白鲢骨骼肌丝氨酸蛋白酶抑制剂对急性T细胞白血病细胞Jarkat、人骨髓瘤细胞Sp20和人骨瘤细胞MG63生长的影响,结果发现该抑制剂对以上3种肿瘤细胞的增殖都有抑制作用,而且抑制作用呈剂量依赖性。本研究旨为进一步研究白鲢骨骼肌丝氨酸蛋白酶抑制剂的纯化及其抗肿瘤作用提供科学依据。

【目的】为提高苦参碱的杀虫效果,对松材线虫的药剂防治靶标乙酰胆碱酯酶1基因(Bx ACE1)进行研究。【方法】松材线虫采集自广东省内马尾松,贝曼漏斗法分离,灰葡萄孢菌苔上25℃避光培养扩繁线虫。克隆Bx ACE1基因全长并进行序列分析,通过基因沉默和蛋白抑制2种技术阻断该基因功能,研究苦参碱的杀虫效果,并应用Q-PCR技术鉴定RNAi效果。【结果】5'和3'序列拼接得到基因全长2 145 bp,命名为Bx ACE1。同源序列多序列比对表明线虫ACE的进化速度与线虫进化速度一致。蛋白质三维结构分析表明,Bx ACE1由14个α螺旋包围着13个β折叠,鉴于氢键数量越多结合越稳定,利用docking...

【目的】克隆鉴定褐飞虱（Nilaparvata lugens）丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Nlserpin2，探明其表达模式和生物学功能。【方法】基于褐飞虱转录组数据，利用PCR技术克隆Nlserpin2全长cDNA序列；利用生物信息学手段分析其核酸和蛋白序列特征；通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测其在褐飞虱不同发育时期（卵、1—5龄若虫和雌雄成虫）和初羽化雌成虫不同组织（脂肪体、肠道和卵巢）中的表达，以及病原真菌金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）侵染褐飞虱5龄若虫不同时间后的诱导表达模式；利用RNAi技术探明Nlserpin2基因沉默对褐飞虱5龄若虫存活率及抵御金龟子绿僵菌侵染能力的影响。【结果】Nlserpin2 cDNA序列（GenBank登录号：KC355239）全长1 209 bp，编码402个氨基酸，含有serpin蛋白超家族所具有的典型serpin结构域和RCL区，且N端包含一段由27个氨基酸残基组成的信号肽。系统进化树分析表明，Nlserpin2与半翅目其他昆虫的serpin聚为一支，其中与白背飞虱（Sogatella furcifera）serpin亲缘关系最近。qRT-PCR分析表明，Nlserpin2表达具有明显的时空特异性，其在褐飞虱成虫中的表达量显著高于其他龄期，且在雄成虫中表达量最高；卵和低龄若虫（1—3龄）中Nlserpin2的表达量显著低于高龄若虫（4—5龄），其中3龄若虫期最低；Nlserpin2在褐飞虱雌成虫肠道、脂肪体和卵巢中均有表达，且肠道中表达量显著高于脂肪体和卵巢。金龟子绿僵菌诱导2 d和3 d后Nlserpin2的表达量显著上调，但随着诱导时间的增加，Nlserpin2表达量呈回稳趋势。RNAi分析结果显示，显微注射ds Nlserpin2可显著抑制Nlserpin2的表达水平。干扰Nlserpin2后褐飞虱5龄若虫的存活率以及对金龟子绿僵菌侵染的抵御能力均显著降低。与对照组相比，Nlserpin2干扰的褐飞虱在金龟子绿僵菌侵染5 d和8 d后的校正存活率分别下降了28.4%和31.0%，且均达到显著水平。【结论】Nlserpin2在褐飞虱防御病原真菌侵染过程中发挥重要作用，可作为应用RNAi技术防控褐飞虱的潜在靶标和褐飞虱高毒力病原真菌遗传改良的资源基因。