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[期刊] 华北农学报
[作者]
欧阳乐军 黄真池 沙月娥 曾富华
根据GenBank中植物病原物诱导型启动子碱基序列设计引物,以烟草基因组DNA为模板,扩增PPP3启动子。用PPP3替换pCAMBIA1301中与gus基因相连的35S启动子,构建重组质粒pCOMBIA+PPP3+gus后导入农杆菌GV3101。通过农杆菌介导的瞬时表达技术将受PPPs控制的gus基因导入烟草。分别接种青枯菌和水杨酸24 h后,烟草叶片中检测到gus基因转录效率分别提高了27.94,17.69倍。表明PPP3启动子具有本底表达水平低、诱导表达活性强的特点。
关键词：
诱导型启动子 瞬时表达 定量PCR
[期刊] 华北农学报
[作者]
欧阳乐军 黄真池 沙月娥 陈良 谢先荣 曾富华
N-酰基高丝氨酸内酯是革兰氏阴性细菌致病过程中的关键信号分子,芽孢杆菌中广泛存在的aiiA基因编码AHL-Lactonase能够水解信号分子AHLs。研究利用PCR方法从枯草芽孢杆菌中克隆了aiiA基因,序列分析表明,该基因由753个碱基组成,编码含有250个氨基酸残基的蛋白质,核苷酸序列与已报道aiiA的同源性为87%～96%。将该基因置于诱导型启动子PPP3调控下,连接到植物表达载体pCAMBIA1301中,成功构建了aiiA基因的植物诱导表达载体pCAM-PPP3-aiiA,为进一步通过转基因技术研究该基因的功能奠定了基础。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
徐广博 李政 赵惠贤 刘香利 赵洁 刘丹 吴静
选择标记基因安全性问题是限制转基因植物商品化种植的重要因素。为了从转基因后代中诱导性剔除选择标记基因,本研究克隆了拟南芥热激蛋白Hsp18.2基因启动子,并构建了Hsp18.2启动子诱导表达的CinH/Rs位点特异性重组删除植物表达载体。结果表明,利用农杆菌介导法进行了烟草转化,转化后的烟草经过除草剂筛选和PCR检测,得到转基因阳性植株。本研究为利用位点特异性重组建立植物无标记基因转化体系奠定了基础。
[期刊] 林业科学研究
[作者]
车代弟 王海峰 王金刚 龚束芳 樊金萍
利用简并引物RT-PCR,克隆复叶槭FtsZ基因的cDNA序列,利用马铃薯X组病毒载体pgR107,构建RNA干扰重组病毒载体pVX-AnFtsZi,并转化农杆菌GV3101(含辅助质粒pJIC Sa-rep)侵染烟草。40 d后,检测烟草内源FtsZ基因的表达量。研究结果表明:从复叶槭中克隆到的569bpFtsZ基因cDNA片段,具有FtsZ蛋白的核心功能序列GGGTGSG。构建的hpRNA型RNA干扰载体抑制了FtsZ基因的表达。为培育槭树类彩叶新品种奠定分子理论基础。
[期刊] 林业科学
[作者]
陈英 戴咏梅 黄敏仁 诸葛强 王明庥
多基因转化是基因工程研究热点之一。本研究应用DNA重组技术,将两个抗病机制不同,抗菌谱较广的抗病基因(天麻抗真菌蛋白GAFP和兔防御素NP1基因)构建在一个植物表达载体pBin35SGAFP-NP1上,两者具有各自的CaMV35S启动子和Nos终止子。通过根癌农杆菌介导,采用叶盘法转化烟草,PCR和PCR-Southern分析证明已将NP1和GAFP基因整合到烟草基因组中。离体抑菌实验表明转基因植株对真菌和细菌表现出一定的抗性。以上结果表明通过该表达载体进行遗传转化可获得含双价抗病基因植物,并能有效表达,提高转基因植物抗病能力。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张丽华 程智慧 李霞
为了验证PR1B分泌肽对谜底蛋白的分泌和增强功能,以GUS基因为靶基因,成功构建了PR1B 和GUS融合基因的植物表达载体,通过三亲融合法转入LBA4404农杆菌,并对烟草进行了转化,在216株卡那抗 性植株中共获得2株GUS染色阳性植株。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
程智慧 吴正景 孟焕文 许小勇
在分析植物液泡转化酶基因保守区序列的基础上,设计1对PCR引物,以番茄(中蔬四号)叶片总RNA的反转录产物为模板,扩增出长为668 bp的cDNA片段,并克隆入pMD-18 T simple载体。测序结果表明,所获得的片段为番茄液泡转化酶基因TIV1的片段;PCR和酶切分析表明,该片段已成功定向连入到双无载体pBinAR的CaMV 35S启动子和OCS终止子间,构建成反义植物表达载体pBinAR-aTIV1;菌落PCR表明质粒成功转化入农杆菌EHA105;瞬时表达证明该反义片段对番茄叶片液泡转化酶活性具有明显的抑制效果。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
孙春莲 王洪洋 田振东
以GFP为报告基因构建植物表达载体pCB302-3-GFP,采用农杆菌叶片注射法对其在本氏烟叶片中瞬时表达条件进行优化。分析基因沉默抑制子p19、菌液不同浓度以及侵染时间对GFP荧光强度的影响,结果显示,当农杆菌菌液D600为0.8~1.0并与含有p19基因的载体共注射条件下,农杆菌注射3~5d后本氏烟草叶片表现出很强的绿色荧光,实现了GFP在本氏烟草中的高效瞬时表达。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
孙春莲 王洪洋 田振东
以GFP为报告基因构建植物表达载体pCB302-3-GFP，采用农杆菌叶片注射法对其在本氏烟叶片中瞬时表达条件进行优化。分析基因沉默抑制子p19、菌液不同浓度以及侵染时间对GFP荧光强度的影响，结果显示，当农杆菌菌液D600 0.8~1.0并与含有p19基因的载体共注射条件下，农杆菌注射3~5 d后本氏烟草叶片表现出很强的绿色荧光，实现了GFP在本氏烟草中的高效瞬时表达。
[期刊] 华北农学报
[作者]
童文艳 胡孟可 徐林娜 乔慧聪 李芬
已知烟草驱动家族新成员NtTkr尾部第3个卷曲螺旋(Coiled-coil, CC3)第1 084位苏氨酸(T_(1084))对靶蛋白的结合至关重要,通过对NtTkr尾部的酵母双杂交筛选得到多个与Ntkr互作的候选蛋白。为确定T_(1084)缺失(T_(1084d))或替换(T1084A)突变对NtTkr与这些候选蛋白体外互作的重要性,首先以pBI121-NtTkr为模板,通过重叠延伸PCR扩增得到烟草NtTkr尾部T_(1084d)、T1084A片段并将其克隆入质粒pUC19,经蓝白斑筛选、SmaⅠ-BamHⅠ双酶切鉴定后送去测序,获得正确的T_(1084)缺失和替换的NtTkr尾部;然后将重组的pUC19-T_(1084d)、pUC19-T1084A与pMXB10进行NotⅠ-NdeⅠ双酶切,回收目的片段和载体片段并连接,连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α,筛选得到重组子,进行NotⅠ-NdeⅠ双酶切鉴定,最终成功构建pMXB10-NtTkr-T1084A和pMXB10-NtTkr-T_(1084d)原核表达载体;最后将原核表达载体pMXB10-T_(1084d)和pMXB10-T1084A转入BL21(DE3)中,分别经0.05,0.06 mmol/L IPTG浓度诱导,12%SDS-PAGE电泳检测蛋白质表达情况,结果证明获得了NtTkr-T_(1084d)-1317和NtTkr-T1084A-1320的成功表达,且IPTG浓度大于0.06 mmol/L时,均可高效表达约77 ku的NtTkr-T1084A-1320和76.2 ku的NtTkr-T_(1084d)-1317蛋白量。
[期刊] 浙江林学院学报
[作者]
卓仁英 孙宗修
全球20%的耕地和近半数的灌溉土地都受到不同程度的盐害威胁,抗盐育种具有重要意义。针对常规育种周期长等明显的局限性,利用抗盐转基因可以迅速获得抗盐材料,明显缩短育种周期。利用PCR技术克隆获得Rd29A这一干旱、盐碱等逆境诱导表达的特异性启动子,与叶绿体转运肽和甜菜碱醛脱氢酶基因构建pBinRdMCS重组质粒,用于林木转化。通过克隆Rd29A启动子构建逆境诱导的高效表达载体,可对林木抗盐转基因育种提供理论指导。图5参8
关键词：
林木 抗盐 Rd29A启动子 BADH
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王青 张彦明 王选年 张改平 胡建和 杨苏珍 赵东 邢广旭 徐彦召 赵光辉 段艳华
应用PCR扩增出新城疫病毒F基因,将其克隆入pGEM-T载体,测序。然后将NDVF基因与高效的真核表达载体pcDNA4/HisMax相连,构建NDVF基因重组真核表达质粒pc4F,采用Superfect转染试剂将pc4F瞬时转染COS-7细胞,应用细胞免疫组化法检测其在细胞中的表达情况。结果表明,F基因能够在COS-7细胞中成功表达。
关键词：
新城疫病毒 F基因 真核表达
[期刊] 华北农学报
[作者]
丛丽君 王滨 段艳欣 吴军帅 冯静
为构建桃果胶乙酰酯酶(PpPAE)基因的原核表达载体pET-32a(+)-PpPAE,并获得稳定高效表达的重组蛋白,以青岛市现代农业质量与安全工程重点实验室前期获得的PpPAE基因(GenBank登录号KF017595)序列为依据,设计引物并扩增其cDNA片段,重组到原核表达载体pET-32a(+)中,将重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,并用IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表达产物。结果表明,已成功构建原核表达载体pET-32a(+)-PpPAE,重组质粒在0.1 mmol/L IPTG浓度下诱导4 h后,有大量融合蛋白表达,分子量约为64 kDa。为进一步研究该蛋白的...
关键词：
桃 果胶乙酰酯酶 原核表达
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
袁友泉 李超超 许馨月 张志宏 刘月学
为研究草莓ＡＰ１同源基因ＦＡＡＰ１的功能，构建了其植物表达载体ＰＢＩ１２１－ＦＡＡＰ１，并导入到农杆菌菌株ＧＶ３１０１中。利用花序浸染法将该基因导入拟南芥，经抗性筛选、ＰＣＲ检测表明获得了３个转化株系。结果显示，与对照相比，转基因株系明显早花，成花时间可提早１０ｄ以上；同时其营养生长受到抑制，植株个体矮小，莲座叶数目减少；在早花的同时，转化株系花器官异常，不能形成种子。表明草莓ＦＡＡＰ１基因参与了成花过程的调控。
关键词：
草莓 FaAP1 拟南芥 超表达
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
袁友泉 李超超 许馨月 张志宏 刘月学
为研究草莓AP1同源基因Fa AP1的功能,构建了其植物表达载体p BI121GFa AP1,并导入到农杆菌菌株GV3101中.利用花序浸染法将该基因导入拟南芥,经抗性筛选、PCR检测表明获得了3个转化株系.结果显示,与对照相比,转基因株系明显早花,成花时间可提早10d以上;同时其营养生长受到抑制,植株个体矮小,莲座叶数目减少;在早花的同时,转化株系花器官异常,不能形成种子.表明草莓Fa AP1基因参与了成花过程的调控.
关键词：
草莓 Fa AP1 拟南芥 超表达
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