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[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
董宏平 彭建令 余晓江 赵静 王颖 董汉松
建立了从不同植物中克隆抗病性信号传导调控基因及检测其表达的方法 ,并优化了相关条件。用RT PCR和PCR方法从拟南芥、烟草、番茄、中华鳖中克隆了 7个信号传导通路中 18个调控基因的cDNA和DNA序列 ,它们分别是 :抗病基因Pto介导的蛋白激酶级联中的Pti4、Pti5和Pti6 ,细胞编程死亡通路中的Hin1和hsr2 0 3,水杨酸介导的系统性获得抗病性通路中的NPR1,乙烯信号通路中的ETR1、ERS1、CTR1、EIN2和ERF1,茉莉酸信号通路中的COI1,核黄素信号通路中的RFBP和LR ,脱落酸信号通路中的ABF3、ABF4和ABH1,以及调控不同信号通路的通调基因NDR1...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
吕贝贝 孙伟伟 李亮 董汉松
核质转运过程是真核生物对信号传导进行精密调控的重要途径,核输入载体蛋白(importin,IMP)和核孔蛋白(nucleo-porin,Nup)对此承担重要功能。植物擅长使用这两类蛋白质对抗病防卫反应信号传导进行调控,影响多种激素信号传导通路。水杨酸、乙烯、茉莉酸是介导植物防卫反应的最重要的激素信号,水杨酸信号传导靠含锚蛋白序列的NPR1来调控系统性获得抗性(systemic acquired resistance,SAR),并经常与乙烯或茉莉酸对抗,而茉莉酸与乙烯常常协作。已知完全测序的拟南芥基因组至少含有26种IMP基因和18种Nup基因。据他人和笔者最近研究,IMP和Nup基因至少分别有...
关键词：
核质转运 信号传导 防卫反应 植物抗病性
[期刊] 华北农学报
[作者]
朱红林 沙爱华 符秀梅 李小靖 陈银华 单志慧 邱德珍 周新安
以高油大豆中豆32开花后30 d的种子为材料,根据已报道的拟南芥脂肪酸合成相关转录因子LEC1序列设计简并引物,采用同源序列法从大豆种子中分离了大小为850 bp的cDNA片段,测序结果表明,该片段与拟南芥中已克隆的脂肪酸合成基因高度同源,包含完整的读码框,采用酶切连接和gateway技术构建了该基因的超量表达和RNAi植物表达载体。为借助农杆菌介导法将LEC1基因转化到大豆再生植株中,对分离的LEC1基因进行功能验证,培育高油大豆新品种奠定了基础。
关键词：
LEC1基因 基因克隆 载体构建 大豆
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
丛斌 张明珠 胡志凤 段立佳 王晓静 张统书 董辉
为克隆米蛾［ＣｏｒＣｙｒａ ＣｅｐｈａｌｏｎｉＣａ（Ｓｔａｉｎｔｏｎ）］β－ａＣｔｉｎ基因ＣＤｎａ片段，建立米蛾β－ａＣｔｉｎ基因实时荧光定量ｐＣｒ（ｑｒｔ－ｐＣｒ）方法，并评估其在实时荧光定量研究中作为内参基因的可靠性，利用反转录ｐＣｒ（ｒｔ－ｐＣｒ）技术克隆获得米蛾β－ａＣｔｉｎ基因ＣＤｎａ片段，采用ＳｙＢｒ ＧｒｅｅｎⅠ染料法建立ｑｒｔ－ｐＣｒ方法，检测在米蛾卵、幼虫、蛹和成虫４个虫态中β－ａＣｔｉｎ基因的表达量。获得了长为８２２Ｂｐ的米蛾β－ａＣｔｉｎ基因片段（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ ａＣＣｅＳＳｉｏｎ：ｋＪ５９９５６９），编码２７３个氨基酸残基；荧光定量标准曲线的Ｃｔ值检测范围为１３～２８．．．
[期刊] 林业科学
[作者]
陈英 戴咏梅 黄敏仁 诸葛强 王明庥
多基因转化是基因工程研究热点之一。本研究应用DNA重组技术,将两个抗病机制不同,抗菌谱较广的抗病基因(天麻抗真菌蛋白GAFP和兔防御素NP1基因)构建在一个植物表达载体pBin35SGAFP-NP1上,两者具有各自的CaMV35S启动子和Nos终止子。通过根癌农杆菌介导,采用叶盘法转化烟草,PCR和PCR-Southern分析证明已将NP1和GAFP基因整合到烟草基因组中。离体抑菌实验表明转基因植株对真菌和细菌表现出一定的抗性。以上结果表明通过该表达载体进行遗传转化可获得含双价抗病基因植物,并能有效表达,提高转基因植物抗病能力。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
陈新 陈华涛 万建民 翟虎渠
利用简并引物从小豆中扩增出1条与植物几丁质酶基因高度同源的片段,命名为VaAC1,通过RACE技术延伸VaAC1基因的3'端和5'端,VaAC1基因完整ORF长度为885 bp,编码294个氨基酸,拥有几丁质酶蛋白家族典型保守结构域GH18_chitinase-like。RT-PCR分析表明,VaAC1基因在小豆根、茎和叶中均有表达,且在叶中的表达相对较高;大豆花叶病毒处理后,VaAC1基因在叶中的表达量显著增强,显示小豆VaAC1基因与病毒病密切相关。
关键词：
小豆 基因克隆 VaAC1基因 表达分析
[期刊] 华北农学报
[作者]
王慧珍 张朝政 黄一鸣 黎耀心 程子洋 乐超银
为探究RPM1在高粱抗病过程中的作用，以高粱抗黑穗病品种SX44B为材料，采用同源克隆法获得一个高粱SbRPM1基因。生物信息学分析结果显示：该基因的cDNA全长2 802 bp,预测共编码933个氨基酸。该基因编码蛋白的理论分子质量为106.1 ku,等电点为7.11,为亲水性蛋白质；该蛋白无跨膜结构，亚细胞定位在细胞质中。保守结构域分析显示，SbRPM1蛋白含有RX-CC-like、NB-ARC和LRR结构域，属于NLRs受体蛋白家族中的CNL类蛋白。系统发育关系分析表明，SbRPM1蛋白与南荻RPM1蛋白亲缘关系最近。通过实时荧光定量PCR技术检测SbRPM1基因的表达模式，结果表明，该基因在叶和花序中表达量较高，其次是根，在茎中表达量最低。在接种丝黑穗病原菌后24～72 h抗病品种中SbRPM1基因的表达显著上调，表明该基因受病原菌诱导表达，在高粱抗病反应中扮演着重要角色。首次在高粱中克隆得到SbRPM1基因CDS序列，解析了该基因的结构、性质与表达的特征。
[期刊] 华北农学报
[作者]
姚梦瑶 李娟 刘志刚 蔡大润 李晓荣 李波 杨洋 王子轩 王勇攀 陈勋基 耿洪伟 陈果
盐碱胁迫已成为制约我国农业生产的重要因素之一，探索农作物耐盐分子机理，对作物育种具有重要的理论价值和实际应用价值。旨在克隆玉米中的ZmMPI基因，转化玉米植株。首先通过qRT-PCR对盐碱溶液处理下植株中的ZmMPI表达量变化进行分析，之后利用DNAMAN软件对ZmMPI蛋白序列进行多重比较分析同时利用MEGA 7.0软件构建系统发生树，并利用一系列软件对ZmMPI进行生物信息学分析。最后利用分子克隆技术，成功克隆ZmMPI基因的编码序列，构建植物过表达载体并利用农杆菌介导的遗传转化方法转化玉米自交系B104,在基因组水平、转录水平以及蛋白质水平对过表达转基因植株鉴定，分析其表达量变化。结果表明，ZmMPI基因的表达量受盐碱胁迫后整体呈现出先上升后下调的趋势；ZmMPI蛋白序列比较结果相似率为64.15%,系统发生树显示，ZmMPI与玉米(小颖大刍草亚种) ABA34115.1同源性最高，该蛋白含有一个蛋白结构域Potato＿inhibit,有α螺旋结构、无规则卷曲结构和β转角结构，偏疏水性，预测潜在的磷酸化位点有10个；对获得的49个转化事件鉴定结果显示，其中有13个过表达转基因株系中的ZmMPI基因在基因组水平能正常表达，有10个过表达转基因株系中的ZmMPI基因能正常转录、翻译。最终获得10个能够正常转录翻译的过表达转基因株系，为进一步探究ZmMPI基因响应盐碱胁迫的分子机制奠定基础。
[期刊] 华北农学报
[作者]
郭悦 姜平平 潘雷雷 周文杰 徐磊 张茹琴 隋炯明 郭宝太 王晶珊 乔利仙
为了探讨花生几丁质酶在抵御真菌性病害中的作用,克隆了花生几丁质酶基因并通过遗传转化验证了该基因的功能。以花生品种花育23号基因组DNA和RNA为模板,通过PCR及RT-PCR扩增分别获得长度为1 779 bp的花生几丁质酶基因DNA序列及795 bp的全长cDNA序列。DNA及cDNA序列比对结果表明,该基因包含3个外显子和2个内含子,内含子剪切符合"GT……AG"规则,其cDNA序列被命名为Ah-Chi,编码265个氨基酸,Gen Bank注册号为HQ439775。利用NCBI在线Blast进行序列比对,结果表明,该蛋白产物与水稻、玉米、紫花苜蓿、大豆、拟南芥的相关蛋白的同源性分别达到83%,83%,72%,58%,49%。用Ah-Chi替换掉植物表达载体pCAMBIA1301上的Gus基因,成功构建了植物过表达载体pCAMBIA1301-Ah-Chi。利用农杆菌介导法将pCAMBIA1301-Ah-Chi转化花生胚小叶外植体,获得再生小苗,经嫁接移栽获得再生植株。利用PCR扩增筛选获得转基因阳性植株,RT-PCR扩增结果表明,转基因植株中Ah-Chi基因表达量增加。用黑斑病菌接种转基因植株和非转基因对照植株离体叶片7 d后,发现非转基因植株叶片褐化及坏死程度较为严重,而转基因植株叶片褐化及坏死程度相对较轻,初步说明转基因植株抗病性增强。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
黄进强 陈松林 邵长伟 刘洋 林帆 李亚亚 王娜
为研究半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)vasa(Csvasa)基因调控区的功能,在已克隆的Csvasa基因编码序列的基础上,采用基因组步移和PCR扩增的方法克隆得到Csvasa调控区,通过生物信息学方法分析vasa基因5′区,并构建了含Csvasa基因调控区的绿色荧光蛋白(GFP)表达载体(p Csvasa-GFP-T),进一步通过显微注射技术初步验证调控区的驱动活性。结果表明,通过基因组步移和PCR扩增获得Csvasa 5′区5 166 bp和3′区1 655 bp,利用在线生物信息学软件对5′区序列进行分析,发现在转录起始点上游26 bp处存在保守的TATA框,以及...
[期刊] 华北农学报
[作者]
董娜 陈向东 胡铁柱 李淦 张亚娟 茹振钢
为了初步明确39份外引小麦种质中条锈病和白粉病抗性基因组成,利用共分离或紧密连锁的分子标记对抗条锈病基因Yr5、Yr10、Yr18和抗白粉病基因Pm4、Pm13、Pm21进行检测,同时结合田间鉴定,对外引种质的抗病性进行评价。结果表明,携带Yr18基因的种质有6份,对条锈病菌表现近免疫至中抗,抗性表现稳定; Yr5连锁标记S1320阳性的种质有21份,Yr10连锁标记SC200阳性的种质有2份,但标记阳性的种质中抗病性表现不一致,可能跟载体品种的遗传背景有关,利用这些分子标记进行辅助育种时,要结合接种鉴定结果综合判断。Pm4基因基本丧失白粉病抗性,携带该基因的7份种质中仅有1份抗病。在39份种质中,均未检测到抗白粉病基因Pm13和Pm21。此外,有2份种质澳阿优1号和bermude兼具条锈病和白粉病抗性,综合抗病性好,在育种中可以合理利用。为小麦抗病育种亲本选择和种质资源的合理利用提供了参考依据。
关键词：
小麦 抗病基因 分子标记 条锈病 白粉病
[期刊] 中南林业科技大学学报
[作者]
张莉 苏曼琳
以二棱大麦幼苗Hordeum distichon Linn.中提取的总RNA为模板,通过RT-PCR的方法获得与抗旱相关的转录因子基因,并将此基因片段用PMD-19T载体进行克隆,序列分析得知该目的片段HDCS1长约664 bp,含有一个完整的阅读框,其编码的蛋白质属于LEA蛋白,且HDCS1与Genebank中已报道的同源蛋白编码基因HVA1(FJ026803.1)序列相似性为98.64%。以植物表达载体PBIl21为基础,将HDCS1基因连接于组成型启动子CamV35S和NOS终止子之间,构建植物表达载体PBI121-HDCS1并进行PCR和酶切鉴定,为提高植物抗旱性研究奠定了基础。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
尹明安 崔鸿文 樊代明 郭立
以胡萝卜品种 Autumn King的幼苗为材料 ,用 CTAB法提取其基因组 DNA,以 PCR ( Polym eraseChain Reaction)的方法在体外扩增出胡萝卜抗冻蛋白基因 ( afp) ,以 p UCm - T Vector为载体构建成胡萝卜 afp的克隆载体 p TAF,用 Eco R 消化重组质粒 p TAF使其线性化 ,再用 DNA聚合酶 Klenow大片段补平末端 ,然后用Xba 消化 ,获得一末端粘 ,一末端平的目的片段 ( afp)。植物表达载体 p BI12 1用 X ba 和 Sma 双酶切 ,获得一末端粘 ,一末端平的线性质粒。将目的片段与线性质粒在 ...
关键词：
胡萝卜 抗冻蛋白基因 分子生物学
[期刊] 淡水渔业
[作者]
周勇 范玉顶 徐进 马杰 江南 刘文枝 曾令兵
根据鲤疱疹病毒II型(Cyprinid herpesvirus Ⅱ,Cy HV-2)ORF 4基因序列(Gen Bank:JQ815364.1)设计特异性引物,PCR扩增得到ORF 4基因编码框全长序列1 041 bp,将其克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,构建了重组原核表达载体p ET-32a-ORF 4。将p ET-32a-ORF 4重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导得到融合表达的重组蛋白,融合表达的重组蛋白主要以包涵体的形式存在,其分子质量约为57 ku,与预期大小一致
[期刊] 中国农业科学
[作者]
陈善真 李春玲 贾爱卿 王贵平
【目的】利用表达纯化的副猪嗜血杆菌(Haemophilus Parasuis,HPS)外膜蛋白P5(outer-membrane protein P5,OMP5),建立检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA检测方法。【方法】克隆扩增HPS OMP5基因,并将OMP5基因与原核表达载体pET-32a(+)连接,通过PCR、双酶切及测序鉴定后,将阳性重组质粒转化入受体菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。亲和层析法纯化蛋白,尿素梯度透析复性,Western blot鉴定表达产物。将超声破碎抗原和复性蛋白分别按不同浓度包被酶标板,通过方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度及血清稀释度,并对其它条件进行优化...
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