【目的】细胞色素P450(CYP450)是植物三萜皂苷代谢通路中的关键酶,本文从生物信息学角度对其蛋白特性及亲缘关系进行分析。【方法】从已发表的文献及NCBI中搜集植物细胞色素P450序列,分别使用ProtParam、ORFfinder、SignalP4.1、SOPMA、CDD和MEGA6.0工具对其理化性质、开放阅读框、信号肽、二级结构、保守结构域和亲缘关系进行分析。【结果】获得21种植物的23条细胞色素P450序列;这23条序列在基因序列长度、氨基酸数目,pI及氨基酸组成,均表现出较强的一致性;只有美洲商陆、甜菜和甜椒这3条序列有信号肽;二级结构具有明显的一致性,并且α-螺旋和无规则卷曲是主要的结构元件;大多数植物细胞色素P450的保守结构域同属于P450超家族;进化树表明细胞色素P450差异较小。【结论】这21种植物的细胞色素P450蛋白特性差别不大,进化距离也比较近,显示细胞色素P450具有较高的保守性和稳定性。本文将为细胞色素P450酶学特征分析及植物中三萜皂苷代谢研究提供帮助。

【目的】探索甜菜叶蛾产生抗药性的分子机制。【方法】利用RACE技术,从甜菜夜蛾Spodoptera exigua中克隆获得1个细胞色素P450基因的全长cDNA序列。【结果】该基因全长894 bp,开放阅读框411 bp,3′和5′端非编码序列分别为79和213 bp,推导的氨基酸序列编码194个氨基酸,推测编码蛋白质的分子量为22.30 kDa,等电点为8.22。同源性比对分析发现,甜菜夜蛾细胞色素P450基因与斜纹夜蛾Spodoptera litura、甘蓝夜蛾Mamestra brassicae、棉铃虫Helicoverpa armigera和谷实夜蛾Helicoverpa zea细胞色素P450的相似性分别为42%、41%、39%和42%。【结论】研究结果可为今后深入研究甜菜夜蛾细胞色素P450功能提供借鉴和参考。

采用基因克隆技术获取草鱼(Ctenopharyngodon idellus)细胞色素P450 3A(CYP3A)cDNA序列长1 849 bp,包含完整开放阅读框(open reading frame,ORF)1 542 bp,1个终止密码和含polyA信号3′UTR;ORF编码514个氨基酸,含信号肽(29 aa),2个跨膜螺旋区(23 aa,23 aa),血红素结合域(21 aa)和6个底物识别位点(SRS1-6);与其他脊椎动物CYP3A氨基酸序列相似度达60%～92%。用实时定量PCR和分光光度计法分别研究了草鱼肾细胞系(Ctenopharyngodon idellus kidney ...

【目的】昆虫变态发育的启动主要受前胸腺合成分泌的蜕皮激素所调控,而蜕皮激素的合成是由细胞色素P450基因催化完成。家蚕(Bombyx mori)是一种产丝昆虫,蚕业生产中如果能阻断或延迟家蚕蛹变态发育进程,将有利于改进蚕茧处理工艺,提高蚕丝品质。论文旨在鉴定参与家蚕蜕皮激素合成的细胞色素P450基因,从而为人为遗传调节家蚕变态发育提供靶基因。【方法】基于序列同源性比对,筛选家蚕及其他昆虫中参与蜕皮激素合成的P450基因。利用ClustalW软件,分析昆虫蜕皮激素合成相关P450基因的遗传发生关系。通过全基因组表达芯片数据分析及RT-PCR验证,调查家蚕蜕皮激素合成相关P450基因的时空表达特征...

【目的】研究飞蝗(Locusta migratoria)细胞色素P450(CYP450)第四家族(CYP4)中3个基因的功能。【方法】以飞蝗为材料,依据飞蝗EST数据库P450基因预测序列设计引物,利用RT-PCR技术克隆飞蝗细胞色素P450基因的cDNA全长序列,命名为CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1(GenBank登录号:KF857162、KF857163和KF857164)。采用实时定量PCR技术分析CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1在飞蝗各发育阶段以及不同组织中mRNA的表达水平。应用RNA干扰技术沉默CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1,实时定量P...

利用生物信息学手段,对GenBank中18种不同植物CBF1的氨基酸序列进行比对及系统发育树的构建,并对其氨基酸的组成、等电点、亲水/疏水性、蛋白质的二级结构和三级结构及功能域进行分析预测。结果表明:18种不同植物CBF1的N端存在富含精氨酸和赖氨酸残基的核定位信号(NLS)、与DNA结合的AP2核心结构域以及C端的酸性氨基酸。构建CBF1进化树,并对其分子进化进行探讨。CBF1的氨基酸主要是脂肪族类,都含有非极性氨基酸Ala,其蛋白等电点多数为酸性,且为不稳定亲水性蛋白。α-螺旋和无规则卷曲是18种不同植物CBF1最大量的结构元件,而β-转角和延伸链则散布于整个蛋白质中。不同植物CBF1蛋白...

以乙醇为细胞色素P450 2E1的诱导剂,在CHSE-1细胞中研究了该诱导剂与酶活性之间的时间效应关系和剂量效应关系。细胞传代后培养48 h,加入含有不同浓度乙醇的新鲜培养基,孵育诱导24 h,之后加入底物苯胺反应30 min。以苯胺的代谢产物4-氨基酚的生成量来反映CYP2E1活性。苯胺浓度为10～16 mmol/L时CYP2E1活性最大,可达(0.152±0.095)nmol.min-1.mg-1,该浓度范围的苯胺适合用于指示CYP2E1的活性。以Gentox模型对诱导的剂量效应进行拟合,得到一个先升高后降低的曲线,说明乙醇对CHSE-1细胞中CYP2E1有先诱导后抑制作用。拟合方程F(x...

【目的】通过体外饲喂双链RNA(dsRNA),利用RNAi技术沉默麦长管蚜和桃蚜体内细胞色素P450。【方法】采用PCR克隆获得麦长管蚜和桃蚜体内细胞色素P450片段;利用双链RNA合成试剂盒合成麦长管蚜和桃蚜细胞色素P450保守序列的dsRNA;在蚜虫人工饲料中,分别加入终浓度为0、3、5和7.5 ng.μL-1的dsRNA,每个试验组设置3个重复,分别于饲喂后2天、4天、6天、8天统计蚜虫的存活数;利用实时荧光定量PCR技术分析饲喂后目标基因的表达抑制情况。【结果】从麦长管蚜与桃蚜的cDNA中分别克隆细胞色素P450,所克隆片段同源性为90.1%,发现随着dsRNA浓度的增大,麦长管蚜和桃...

【目的】对三色堇花色素合成的3个结构基因VwCHS、VwCHI和VwF3 H进行克隆以及生物信息学分析。【方法】利用RACE/PCR技术克隆得到VwCHS、VwCHI和VwF3 H基因的全长序列,并通过在线分析软件对其生物信息学进行分析。【结果】获得VwCHS、VwCHI和VwF3 H的cDNA全长分别是1 481,975和1 361bp;经多重序列比对发现这3个基因编码的氨基酸与其他植物相关氨基酸一致性较高,主要集中在62%~90%,并且在CHS氨基酸序列中有4个催化活性位点(Cys171、Phe222、His310、Asn343),在CHI氨基酸序列中有4个催化活性位点(Thr50、Tyr...

在前期利用SSH筛选到抗旱相关基因HuABAR的Unigene序列的基础上,进行了HuABAR的全长cDNA克隆、生物信息学分析及亚细胞定位。结果表明:HuABAR基因cDNA全长为1 239bp,5′-UTR为264bp,3′-UTR为414bp,完整开放阅读框(ORF)共561bp,编码187个氨基酸;生物信息学分析显示,HuABAR基因编码蛋白具有典型的SRPBCC结构域,并与PYR1/PYLs(pyrabactin resistance 1/PYR1like)家族具有较高的相似性;HuABAR在干旱、高温(42℃)和低温(4℃)等逆境胁迫下显著上调表达,并在干旱胁迫5d、高温3d时表达量最高,低温处理5d内,表达量持续上升;通过PEG介导法瞬时转化拟南芥原生质体进行亚细胞定位分析,发现该基因定位于细胞质,与已报道的其他PYR1/PYLs家族基因一致。因此,HuABAR基因可能在火龙果干旱胁迫应答中发挥重要作用。

运用生物信息学的方法,对已在Genbank数据库中注册的菠菜、甜菜、拟南芥、陆地棉和辽宁碱蓬等中磷酸胆碱合成的关键酶磷酸乙醇胺甲基转移酶(PEAMT)的氨基酸序列进行分析。结果显示:植物PEAMT属于稳定蛋白质,含有较丰富的赖氨酸和亮氨酸;不同植物PEAMT的氨基酸序列具有较高的同源性,含有与SAM结合的保守结合域及Tyr-His氨基酸对;植物PEAMT属于胞质酶,不与膜结合;分子进化研究表明PEAMT可作为植物遗传分化和分子进化研究的重要依据;氨基酸序列中不存在信号肽;分子中不存在跨膜结构域,可能受蛋白激酶C的磷酸化;无规则卷曲是多肽链中的主要结构元件;蛋白质保守区域包含两个AdoMet-M...

利用已经分离的植物液泡加工酶(vacuolar processing enzyme,VPE)蛋白家族的Peptidase_C13结构域序列为检索序列,对拟南芥和水稻中的VPE家族成员进行序列分析,同时利用所有成员的氨基酸序列构建系统进化树,并对其中的保守序列以及信号肽区段和亚细胞定位进行了分析。结果表明:1)结合同源序列的搜索和结构域的鉴定,最终在拟南芥和水稻中确定了8个和13个VPE,其中2个拟南芥和11个水稻VPE成员为首次报道;2)蛋白系统进化分析表明,该基因家族的基本特征在拟南芥和水稻分离之前就已经形成;3)多序列联配以及MEME分析表明,Peptidase_C13结构域在VPE家族成...

为了解类植物乳杆菌L-XM1 plnBCD编码蛋白的生物学特性,并推测其功能,综合运用RPS-Blast、InterProscan和TMHMM Server等多种生物信息学软件预测分析plnBCD编码蛋白的理化性质、疏水性、磷酸化位点、保守性功能域及二级结构,并用Swiss-model同源建模。结果表明:plnB编码蛋白为疏水性蛋白,定位于细胞质膜上,有6个跨膜区、21个磷酸化位点和1个HATPase_c结构域,具有大多数组氨酸蛋白激酶的基本性质。其二级结构以α-螺旋和延伸链为主要构件,其空间结构与组氨酸蛋白激酶的结构特征一致。plnC及plnD编码蛋白均为亲水性蛋白,不具有跨膜区,定位于细胞...

【目的】以世界性害虫马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)为研究对象,筛选其参与噻虫嗪解毒的细胞色素P450主效基因。【方法】于2018、2019年利用点滴法监测新疆察布查尔县、伊宁县、塔城市、乌鲁木齐市和吉木萨尔县11个马铃薯甲虫田间种群对噻虫嗪的抗性水平,并测定分析噻虫嗪LD_(50)处理72 h后成虫中3种主要解毒酶细胞色素P450酶(P450)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)和酯酶(EST)的活性变化。利用Illumina HiSeq~(TM) 2500高通量测序技术进行转录组测序,获得抗性和敏感种群之间的差异表达基因(DEG),运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术验证3个P450基因并分析6个P450基因(CYP4C1、CYP9e2、CYP305a1、CYP9Z25、CYP9Ya和CYP9Yc)在不同种群及噻虫嗪处理后的表达情况。【结果】抗性监测发现,2018年的YN1、URMQ1、TC和QPQL1以及2019年的YN2和JMS种群成虫对噻虫嗪抗性倍数(RR)分别达到5.99、8.81、10.86和20.33倍和11.82、14.05倍,为低至中水平抗性。解毒酶活性测定结果表明,2个敏感种群URMQ2、URMQ3以及2个抗性种群YN2、JMS成虫分别经噻虫嗪LD_(50)处理72 h后其P450活性均显著增加,分别为对照的1.76、2.75、1.91和1.66倍。另外,URMQ3种群的GST(CDNB和DCNB为底物)及URMQ2、YN2种群的EST活性显著升高,分别为对照的1.19、2.10倍和1.35、1.91倍。转录组分析表明,通过合并组装分别获得噻虫嗪敏感和抗性种群样品56 872 051和62 249 136个原始序列数据以及55 903 706和61 082 076个过滤后的序列数据,过滤后的序列长度分别为8.39和9.16 G,碱基错误率均为0.03%。抗性种群中差异表达的P450基因13个,其中2个基因显著上调。3个上调的P450基因CYP4C1、CYP9e2和CYP305a1的qRT-PCR检测结果与转录组测序结果基本一致,qRT-PCR分析还发现CYP9Ya、CYP9Yc、CYP4C1、CYP305a1和CYP9Z25在抗性种群成虫中表达量显著增加,噻虫嗪LD_(50)处理均可引起URMQ2种群4龄幼虫和成虫CYP9Ya、CYP9Yc表达量显著上调。相关性分析发现成虫对噻虫嗪的抗性水平与CYP9Ya表达量呈显著正相关。【结论】CYP9Ya可能在马铃薯甲虫中对噻虫嗪具有重要的解毒作用,其他基因的作用也不能排除。

探究陆地棉细胞色素P450基因GhP450-94C1在棉花黄萎病反应中的生物学功能,为棉花黄萎病抗性基因挖掘及抗病育种奠定基础。通过转录组筛选,克隆获得一个细胞色素P450基因GhP450-94C1,利用生物信息学的方法分析该基因的理化性质,通过荧光定量PCR技术分析GhP450-94C1在黄萎病侵染下的表达模式,利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术初步探究其在棉花抗黄萎病反应中的生物学功能,结果表明:克隆获得一个陆地棉细胞色素P450基因GhP450-94C1,其开放阅读框(ORF)为1503bp,编码一个含500个氨基酸的酸性、亲水性、不稳定的跨膜蛋白,分子式为C_(2597)H_(4025)N_(691)O_(725)S_(22),相对分子质量为57.23ku,定位于内质网膜,含有一个P450结构域;有86.45%的概率存在信号肽;二级结构预测显示该蛋白含有24个α螺旋和8个β折叠;该基因响应黄萎病菌侵染,抑制其表达后植株对黄萎病菌的敏感性增强;初步证明GhP450-94C1是棉花黄萎病抗性反应的一个正向调控因子。