【目的】克隆棉铃虫中肠羧酸酯酶基因,了解该酶的分子特性,为研究棉铃虫抗药性机理奠定基础。【方法】制备抗血清,对棉铃虫(Helicoverpa armigera(Hübner))中肠cDNA表达文库进行免疫筛选,得到编码棉铃虫羧酸酯酶基因的cDNA克隆,利用生物信息学软件和网站进行序列分析,构建原核表达载体进行表达,并以α-醋酸萘酯溶液为底物进行活性测定。【结果】测序分析表明,羧酸酯酶基因hc3(GenBank登录号:GU119888)全长2 896 bp,编码795个氨基酸。羧酸酯酶HC3的等电点pI为3.94,活性中心包括3个氨基酸残基(催化三联体):Ser204,Glu331,His444...

昆虫围食膜是保护其中肠的一道物理屏障,破坏围食膜就可能使其中肠处于不正常的生理状态而最终导致死亡。本研究提取棉铃虫Helicoverpa armigera(Hbner)围食膜蛋白,成功制备棉铃虫围食膜蛋白多克隆抗体,并对棉铃虫中肠cDNA表达文库进行免疫筛选,共得到385个阳性克隆。对其中26个克隆进行鉴定并测序分析,结果表明19个克隆为肠粘蛋白。过碘酸-希夫试剂(PAS)显色法检测棉铃虫围食膜蛋白组成,发现围食膜蛋白大部分为糖蛋白。通过对棉铃虫中肠围食膜蛋白的分离鉴定,为进一步分析棉铃虫围食膜蛋白的生理功能,寻找生物防治新靶标,开发新型高效生物杀虫剂提供理论依据。

【目的】克隆、分析和原核表达编码棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)信息素结合蛋白HarmPBP2的cDNA,并纯化得到HarmPBP2蛋白。【方法】以棉铃虫触角为材料,通过RT-PCR技术以获得编码中棉铃虫信息素结合蛋白HarmPBP2基因成熟蛋白开放阅读框序列,使用半定量RT-PCR对表达谱进行研究,并在使用pGEX-4T-1表达载体在BL21(DE3)系统中进行原核表达,使用GSTrapFF预装柱进行纯化并切去标签。【结果】克隆了命名为HarmPBP2(GenBank登录号:EU647241)的棉铃虫信息素结合蛋白基因,该序列全长457bp,编码149个氨基酸残...

【目的】克隆获得棉铃虫(Helicoverpa armigera)磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidylethanolamine binding protein,PEBP)的c DNA序列,分析Ha PEBP在棉铃虫体内的表达规律,检测2-十三烷酮处理条件下棉铃虫体内Ha PEBP的变化情况,为进一步明确棉铃虫PEBP的功能和选择该基因作为调控棉铃虫种群数量的分子靶标提供依据。【方法】利用RACE技术从棉铃虫6龄幼虫的中肠组织中扩增得到Ha PEBP的c DNA序列,并对其氨基酸序列和蛋白结构进行分析。将Ha PEBP的ORF序列连接至p ET32a载体并转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后检测目的蛋白的表达形式,并通过镍柱的亲和层析纯化融合蛋白。最后通过实时荧光定量PCR检测棉铃虫幼虫不同时期和6龄幼虫不同组织中Ha PEBP的表达规律,以及2-十三烷酮处理棉铃虫6龄幼虫后中肠内Ha PEBP的变化规律。【结果】获得的Ha PEBP c DNA序列长760 bp,其中ORF为588 bp,编码195个氨基酸,蛋白质分子量和等电点分别为21.76 k D和5.93。氨基酸序列分析表明Ha PEBP无信号肽、跨膜结构域和二硫键,是一个由4个α螺旋和9个β折叠片组成的胞质单体蛋白。将BL21(DE3)-p ET32a-Ha PEBP重组菌用1 mmol·L-1的IPTG在37℃条件下诱导4 h,约40 k D的融合蛋白His-Ha PEBP能以可溶的形式存在于重组菌中。按照同样的方法诱导1 L的重组菌,将超声处理后的上清液与Ni-NTA柱结合,进行咪唑缓冲液梯度洗涤,200 mmol·L-1的咪唑洗涤两次后得到约40 k D的单一蛋白,与融合蛋白的大小一致。将此流出液超滤浓缩,获得183.3 ng·μL-1的融合蛋白,能被抗His-Tag的单克隆抗体识别发生免疫反应。Ha PEBP在棉铃虫幼虫的1—6龄期和预蛹期均表达,且6龄幼虫的表达量最高。该基因在6龄幼虫的脂肪体、中肠、头部和体壁中也均有表达,且脂肪体内的表达量最高。不同浓度的2-十三烷酮处理后,棉铃虫6龄幼虫中肠内Ha PEBP的表达量均有所降低;低浓度(2.5和5 mg·g-1)在6 h就能降低Ha PEBP的表达量,其m RNA含量随着时间的延长逐渐增加;而高浓度(10和15 mg·g-1)在12 h才会降低Ha PEBP的表达量,其m RNA含量随着时间的延长先下降后上升。【结论】克隆分析了Ha PEBP,利用大肠杆菌系统表达出可溶的融合蛋白His-Ha PEBP,并通过镍柱-咪唑纯化法得到了高纯度的融合蛋白,时空表达分析显示Ha PEBP在棉铃虫6龄幼虫和脂肪体中表达量最高,2-十三烷酮处理6龄幼虫后中肠内Ha PEBP的表达量显著降低。

目的了解棉铃虫体内Gqα的组织特异性表达情况。方法利用RACE技术获得了Gqα全长基因,利用半定量RT-PCR研究了该基因的时空表达情况。结果从棉铃虫Helicoverpaarmigera触角中克隆了一条全长1101bp的GqαcDNA序列,命名为GqαHarm;阅读框全长1062bp,编码353个氨基酸残基。GqαHarm与已报道的昆虫Gq蛋白α亚基同源性在90%以上,与近缘种甘蓝夜蛾MamestrabrassicaeGqα的同源性高达96.88%,与家蚕BombyxmoriGqα的同源性高达97.73%。半定量RT-PCR研究表明,GqαHarm在棉铃虫雌雄成虫触角中表达,在头、胸、腹、足...

【目的】克隆及序列分析棉铃虫(Helicoverpa armigera)α-微管蛋白基因的cDNA序列,并检测棉铃虫α、β两种微管蛋白基因的表达情况。【方法】以棉铃虫3龄幼虫为试验材料,采用RT-PCR及RACE技术克隆棉铃虫α-微管蛋白基因(HeTubA),采用荧光定量PCR(QRT-PCR)技术分析棉铃虫α、β-微管蛋白基因在不同生长发育阶段及成虫器官中的表达模式。【结果】克隆得到棉铃虫α-微管蛋白基因(GenBank登录号为JQ069957)。序列分析表明,HeTubA开放阅读框1 353 bp,编码450个氨基酸组成的多肽,氨基酸序列包含多个α-微管蛋白保守区。与其它一些昆虫的一致性分...

【目的】克隆大豆蚜羧酸酯酶基因,了解该酶的分子特性,为研究大豆蚜抗药性机理奠定基础。【方法】利用RT-PCR和RACE技术,克隆了1个大豆蚜羧酸酯酶基因的全长cDNA序列,命名为AgCarE,利用生物信息学软件及网上工具进行序列分析,以pET-21b为载体构建原核表达系统进行表达,并以α-醋酸萘酯溶液为底物进行活性测定。【结果】测序分析表明,羧酸酯酶基因AgCarE(GenBank登录号:JF970181)全长1 946 bp,编码526个氨基酸。羧酸酯酶AgCarE的等电点(pI)为6.08,蛋白活性中心包括3个氨基酸残基(催化三联体):Ser186、Glu313、His434,5个N-联糖...

以对有机磷杀虫剂敏感的品系(SS) 和抗性的品系(R2) 为试虫材料, 利用生测和生化分析两种方法研究了羧酸酯酶在棉铃虫对有机磷杀虫剂抗性形成中的作用。结果表明: TPP对久效磷、辛硫磷的增效比在R2品系中分别为2.76 和2.46倍, 在SS品系中分别为1.85 和1.48 倍; 两品系羧酸酯酶的Km 和Vm ax之间存在显著的差异, R2 和SS品系羧酸酯酶的米氏常数Km 、Vm ax分别为76.74 μm ol/L、56.29 nm ol/ (m in·m g) 和107.39 μm ol/L、44.40 nm ol/ (m in·m g); 两品系的羧酸酯酶对TPP、久效磷和辛硫磷的抑...

【目的】通过比较Cry1Ac抗、感棉铃虫昆虫中肠碱性磷酸酶(ALP1)表达量的差异及抗性棉铃虫取食Cry1Ac蛋白对ALP1表达量的影响,分析ALP1表达量变化与抗性的关系,为进一步明确Bt抗性机制、制定抗性治理策略提供理论依据。【方法】利用实时荧光定量PCR技术,比较敏感棉铃虫、Cry1Ac抗性棉铃虫取食含Cry1Ac蛋白的饲料和正常饲料后ALP1表达量的差异。【结果】ALP1在棉铃虫整个发育期都表达,幼虫的表达量最高,蛹期表达量最低,在成虫体内也有较高的表达;ALP1在幼虫中肠表达量最高,其次是后肠、前肠、马氏管,表皮中的表达量最低;与敏感品系相比,对Cry1Ac具有中等水平抗性的棉铃虫A...

棉铃虫核型多角体病毒(HearNPV)ORF44是一个功能未知的基因,研究对HearNPV ORF44基因的序列及原核表达进行了初步研究。结果表明,HearNPV ORF44基因全长1 137 nt,编码378aa,预测编码蛋白分子量为42.7 ku。序列分析显示,ORF44具有双相启动子特征序列,同时兼有杆状病毒早期和晚期基因转录启动子特征序列。ORF44的推导氨基酸序列中含有1个强跨膜螺旋区域,32个磷酸化位点和4个糖基化位点。除HzNPVORF45外,未发现与ORF44氨基酸同源性高于30%的基因。构建了pET-44表达载体,并在大肠杆菌BL21中得到了高效表达,表达的融合蛋白分子量为4...

【目的】通过研究棉铃虫核型多角体病毒(HearNPV)感染宿主昆虫后对宿主中肠碱性磷酸酶(ALP)活性与基因表达水平的影响,明确病毒在侵染宿主过程中对宿主昆虫中肠ALP的调控机理。【方法】采用不同剂量的HearNPV感染3龄棉铃虫,测定感染后不同时间昆虫中肠ALP酶活性及其编码基因表达水平,分析病毒感染试虫与未感染健康试虫的ALP活性和编码基因表达水平上的差异。【结果】HearNPV感染后,能够显著抑制ALP的活性,且抑制作用与感染病毒的剂量和感染后时间的增加呈正相关。ALP活性的下降与病毒下调其编码基因ALP的表达水平有关。【结论】HearNPV感染其宿主昆虫的过程中导致宿主ALP活性显著下...

20 0 0— 2 0 0 1年在新疆喀什叶城县研究了转 Bt基因棉 MD- 80不同发育阶段对棉铃虫的抗性表达和棉田节肢动物群落。结果表明 :1)转 Bt基因棉棉叶对棉铃虫初孵幼虫有 2个抗性高峰即 5月中下旬和 7月底 ,抗虫性分别为 94 .5 %和 83.3% ,8月份抗性最低 (2 2 .7% ) ,而河南的研究表明 8月份正是第 2个抗性高峰 ,抗虫效果高达 93. 8% ;2 ) 7月上旬棉株不同器官抗棉铃虫的强弱依次为 :棉苞叶 (96 .7% )、棉蕾(74 .2 % )、花瓣 (6 0 % )、棉叶 (5 0 .2 % )、棉铃 (30 % )、花蕊 (2 6 .8% ) ...

【目的】研究棉铃虫核型多角体病毒(HearNPV)感染宿主昆虫后对宿主谷胱甘肽S-转移酶(GST)活性与基因表达水平的影响,明确病毒在侵染宿主过程中对宿主昆虫GST的调控作用。【方法】采用50和100PIB/只2种剂量的HearNPV病毒感染3龄棉铃虫,测定感染后不同时间试虫中肠GST活性与其编码基因的表达水平,对比分析病毒感染与未感染健康试虫的GST活性及其编码基因表达水平的差异。【结果】棉铃虫在HearNPV感染初期,GST活性显著提高,同时GST表达水平显著上调;随着感染时间的推移,GST活性与其编码基因的表达水平均显著下降,表明病毒感染后对宿主昆虫GST活性的影响与其对GST表达水平的...

【目的】克隆棉花多酚氧化酶基因(GhPPO1)全长cDNA序列,分析其序列特征,并研究其及多酚氧化酶系对棉铃虫(Helicoverpa armigera)的取食诱导反应,明确其在棉花防御棉铃虫取食中的作用。【方法】根据笔者研究组前期从棉花SSH文库中获得的对昆虫取食诱导响应明显的棉花PPO基因序列片段,设计5′RACE特异引物,进行5′端RACE反应,测序后进行序列拼接。拼接序列在NCBI棉花dbEST数据库中,用Blastn程序进行同源检索,获得一条EST(GenBank登录号:DR461072.1)与测序结果有410 bp重复。用DNAstar进行组装、电子延伸,获得一条棉花PPO基因序列...

【目的】明确不同食源异色瓢虫(Harmonia axyridis)胁迫对棉铃虫(Helicoverpa armigera)生长发育和变态发育的影响,探讨棉铃虫是否能感知并分级捕食风险、能否在生长发育和变态发育上体现出权衡效应;明确长时和短时胁迫对棉铃虫压力蛋白基因表达的影响,探讨异色瓢虫胁迫能否引起棉铃虫分子水平上的生理反应。【方法】通过设置7种不同食源的异色瓢虫胁迫处理(饥饿处理、虾卵处理、棉铃虫幼虫处理、棉铃虫卵处理、蚜虫处理、蚜虫对照处理、对照处理),观察记录棉铃虫在胁迫下的生长发育(幼虫历期、蛹历